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[目的]为了研究以三法三穴为代表的推拿手法是否通过影响cAMP-PKA信号通路进而促进SNI大鼠的损伤恢复,本研究以大鼠坐骨神经损伤模型(Sciatic Nerve Injury,SNI)为例,通过利用行为学、组织形态学、分子生物学技术对大鼠坐骨神经损伤后的情况进行综合评价,观察SNI大鼠的感觉功能和神经损伤的修复情况,探究推拿的起效机制,为推拿治疗周围神经损伤提供科学依据。[方法]以SD大鼠作为实验动物,将SD雄性大鼠分为正常组、假手术组、模型组及三法三穴组。模型组及三法三穴组通过坐骨神经夹持建立SNI模型,三法三穴组选择殷门、承山、阳陵泉三穴并使用“按摩推拿手法模拟仪”操作点法、拨法、揉法进行干预,每穴每法各1min。运用光热耐痛阈实验来评价大鼠感觉功能(痛温觉)的恢复,运用坐骨神经功能指数评价大鼠神经功能和后肢精细动作恢复情况;运用HE染色、尼氏染色和免疫荧光技术观察坐骨神经及DRG神经元形态;运用分子生物学技术检测背根神经节(DRG)中cAMP、PKA、CREB的表达情况,通过定性定量的检测方法,结合行为学、形态学结果进行综合分析,评价推拿对SNI大鼠感觉功能及神经功能恢复的影响,阐释推拿促进周围神经损伤修复的机理。[结果]1.光热耐痛阈实验—推拿能促进SNI大鼠感觉功能(痛温觉)的恢复光热耐痛阈结果显示SNI大鼠左足(正常侧)的实验结果组间(正常组、假手术组、模型组及三法三穴组)比较无统计学差异,而右足(患侧)差异较明显。造模后7d,正常组与假手术组结果相比无明显差异,而模型组明显高于正常组与假手术组(P<0.05),提示夹持损伤导致了坐骨神经损伤,神经纤维出现了连续性中断,痛觉传导功能受损。推拿20d后,三法三穴组SNI大鼠的舔舐足部时间明显较造模后7d时缩短,低于模型组(P<0.05)。2.坐骨神经功能指数(SFI)—推拿能改善SNI大鼠的后肢精细动作和受损神经恢复造模后7d,正常组与假手术组实验结果无明显差异,模型组SFI指数与假手术组相比有所降低(P<0.05)。此时可见坐骨神经损伤后大鼠患侧后肢出现无法受力及严重跛行的情况。干预20d后,模型组指数仍低于假手术组(P<0.05),而三法三穴组指数高于模型组(P<0.05)。3.坐骨神经HE染色—推拿能改善SNI大鼠坐骨神经的结构正常组及假手术组坐骨神经神经纤维结构正常,纤维排列规则有序;模型组神经纤维局部区域排列凌乱松散,纤维丝断裂,神经纤维丝变细或减少;三法三穴组神经组织相较于模型组神经纤维排列规则有序,结构致密,组织结构大体趋向正常。4.尼氏染色—推拿能促进SNI大鼠坐骨神经和DRG形态恢复坐骨神经:正常组可见坐骨神经纤维整体有序,纤维横切面结构完整正常;假手术组中神经纤维细胞排列规则有序,结构致密;模型组中神经纤维横切面可见纤维排列疏松,结构紊乱,神经纤维丝断裂;三法三穴组中神经纤维排列规则有序,部分神经纤维丝结构较细,染色较浅。DRG:正常组中多数神经元细胞中尼氏颗粒清晰,数量丰富,神经元细胞结构正常;假手术组多数神经元细胞中尼氏颗粒清晰,数量丰富,神经元细胞结构正常;少量神经元胞体中尼氏小体崩解至完全溶解消失,胞浆淡染,细胞肿胀;模型组中尼氏体颗粒在所有神经元细胞中整体减少,尼氏染色淡染;较多神经元胞体中尼氏体崩解为细尘状颗粒,进而完全溶解消失;因尼氏体消失,胞浆着色浅,胞体肿胀,细胞由多极形状变为圆形;三法三穴组较模型组神经元细胞中尼氏颗粒清晰,数量丰富,神经元细胞结构正常;少量神经元胞体局部区域尼氏小体崩解至细尘状颗粒,并渐渐向外扩展,胞浆淡染,细胞肿胀。5.荧光染色—推拿能保护并促进SNI大鼠感觉神经元恢复正常组大鼠DRG中神经元大多呈圆形或三角形,核仁居中,染色清晰,形态饱满;假手术组神经元形态与正常组相似;模型组可见神经元数目减少,形态皱褶增多或破裂,有轻微水肿现象,直径增加,核仁部分出现偏移或消失现象;三法三穴组在干预后20d,神经元染色较为清晰,神经元数量较多,核仁大多居中,形态恢复较为饱满。6.Western-blotting—推拿能通过促进通路关键蛋白表达促进坐骨神经恢复6.1 DRG中cAMP表达情况造模后7d,正常组与假手术组cAMP表达量无明显差异;与正常组比较,模型组表达水平显著降低(P<0.05);干预20d时,与模型组相比,三法三穴组cAMP表达水平呈明显升高趋势(P<0.05),三法三穴组与模型组相比差异较大(P<0.05)。6.2 DRG中PKA表达情况造模后7d,正常组与假手术组PKA表达量无明显差异,与正常组比较,模型组PKA表达水平显著降低(P<0.05);干预20d后,与模型组比较,三法三穴组PKA表达量升高明显(P<0.05);差异较大。6.3 DRG中CREB表达情况造模后7d,正常组与假手术组CREB表达量无明显差异,与正常组相比,模型组表达量虽有所下降但差异不明显;干预20d后,与模型组相比,三法三穴组CREB表达量可以观察到有上升的表现,但无统计学差异。以上结果提示:推拿可以提高DRG中cAMP、PKA、CREB蛋白的表达,进而促进周围神经损伤的恢复。[结论]以三法三穴为代表的推拿手法可以提高DRG中cAMP、PKA、CREB的表达,通过影响cAMP-PKA通路中的三个关键蛋白,从而激活通路;同时也可改善SNI大鼠DRG中神经元的形态,恢复坐骨神经超微结构,加速SNI大鼠感觉功能和后肢精细动作的恢复,进而起到促进周围神经损伤后修复的作用。说明以三法三穴为代表的推拿治疗周围神经损伤的机制之一是激活cAMP-PKA信号通路。