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乳腺癌是当今女性最常见的恶性肿瘤，其发病率居女性恶性肿瘤的首位，死亡率也逐年跃居前列，乳腺癌严重威胁着全球女性的身体健康和生活质量。过去数十年时间里，我国乳腺癌的发病率和死亡率较低，但近10年来上升幅度尤其显著。化疗是乳腺癌治疗的重要手段之一，合理的化疗能明显提高乳腺癌治疗的有效性。临床应用于乳腺癌的化疗药物众多，其中多西紫杉醇应用更为广泛，为治疗转移性乳腺癌的一线用药。化疗药物的耐药问题，在乳腺癌也是如此，对多西紫杉醇的耐药也严重影响乳腺癌治疗的临床疗效和患者预后，故发现介导耐药新靶点对于多西紫杉醇疗效的预测和其个体化临床应用将有重要的意义。选择性剪接是指将同一种的前体mRNA剪接组成多种不同成熟mRNA剪接异构体，最终产生结构和功能各异的蛋白质的一系列过程，又称为可变剪接。蛋白终产物表型变化引起相互拮抗的功能和结构特性。选择性剪接普遍存在于真核细胞生物中，是基因表达复杂性和蛋白质多样性的主要原因。约75%的选择性剪接发生在翻译区，使蛋白有了多样性的变化。选择性剪接影响细胞生理、发育以及疾病等多个环节。研究选择性剪接各项功能与机制及其产生的蛋白异构体的功能，不仅对于各种常见肿瘤的诊断治疗具有重要意义，而且影响深远。转录因子FoxM1广泛存在于各种真核生物的细胞中，是Forkhead转录因子家族中的重要一员。该家族的共同特征是具有进化保守的DNA结合区，即为“翼状螺旋结构”或称“叉头框”。FoxM1在细胞增殖、分化，细胞的衰老、凋亡等过程中起重要作用，其表达与调节细胞有丝分裂、细胞周期密切相关。在FoxM1的三种剪接异构体中，FoxM1b和FoxM1c具有转录活性，但FoxM1a的C端因含有外显子A2而失去转录活性。因此，研究FoxM1尤其是FoxM1b剪接异构体的表达、功能与调控机制等对肿瘤方面具有重要的意义。本课题旨在研究FoxM1b剪接异构体在乳腺癌中的表达，探讨FoxM1b与乳腺癌多西紫杉醇耐药的关系及其调控机制。主要分为三个部分：第一部分：FoxM1及FoxM1b剪接异构体在乳腺癌的表达方面的研究。首先利用一定浓度的多西紫杉醇长期间断刺激人乳腺癌MDA-MB-231细胞，并筛选出耐药细胞系MDA-MB-231/Doc，并进行鉴定，发现耐药细胞在加有各种浓度多西紫杉醇的培养基中，细胞形态及生长状态均明显强于普通的MDA-MB-231细胞。MTT实验验证两种细胞的耐药性，同样得出MDA-MB-231/Doc对多西紫杉醇的耐药性明显强于MDA-MB-231细胞。免疫组织化学染色结果显示，FoxM1在绝大多数人乳腺癌组织中普遍高表达量，主要存在于胞浆和核内。通过RT-PCR实验、Real-timePCR实验及蛋白印记检测多种人乳腺癌细胞中FoxM1蛋白质的表达，包括6株细胞MDA-MB-468,MDA-MB-453，BT-549，MCF-7,MDA-MB-231，MDA-MB-231/Doc。同时对人乳腺癌组织进行Real-timePCR检测其表达。结果显示，FoxM1a，FoxM1b，FoxM1c在6株人乳腺癌细胞中均有一定程度的表达。而FoxM1b剪接异构体的表达要高于FoxM1a及FoxM1c。同时我们还观察到FoxM1b在MDA-MB-231/Doc的表达要明显高于其亲本细胞系MDA-MB-231。第二部分：FoxM1b剪接异构体对乳腺癌细胞中的影响。首先通过细胞转染实验分别用pcDNA3.1-FoxM1b和FoxM1shRNA两种质粒建立过表达FoxM1b的MDA-MB-231细胞，建立干涉FoxM1的MDA-MB-231/Doc细胞，然后用G418筛选出稳转细胞系。通过Real-timePCR与蛋白印迹实验检验其在稳转细胞系中的FoxM1在mRNA水平和蛋白水平的表达。进一步通过MTT和平板克隆实验检测所建立的稳转细胞系的增殖及耐药情况。通过对细胞系进行细胞周期和细胞凋亡实验检测稳转细胞系的细胞周期和细胞凋亡变化。结果显示，在FoxM1b表达量高的细胞MDA-MB-231(FoxM1b)中，细胞增殖能力和耐药性要明显强于原细胞MDA-MB-231(Mock)，而在干涉FoxM1的细胞系MDA-MB-231/Doc(shRNA)，细胞增殖能力和耐药性比原细胞MDA-MB-231/Doc(Mock)出现明显下降。同时发现在使FoxM1b表达量升高后，有细胞分裂增殖过程G2期比率下降和细胞凋亡比率下降。第三部分：FoxM1b参与乳腺癌细胞多西紫杉醇耐药的机制研究。为明确FoxM1b在乳腺癌多西紫杉醇耐药过程中的调控机制，我们对稳转细胞系进行Real-timePCR和蛋白印迹实验检测FoxM1b下游可能的效应分子的表达水平。与多西紫杉醇耐药相关的候选分子有MDR1、XRCC1、ERCC1、BRCA1和BRCA2等。实验结果表明，FoxM1b的表达水平与BRCA1及Bcl-2两种分子存在正相关。免疫组化结果显示，在同一人乳腺癌组织中，FoxM1与BRCA1及Bcl-2均在胞浆与胞核内有较高的表达。利用稳转细胞系进行mRNA水平和蛋白水平的检测，我们发现，在升高FoxM1b表达量后，BRCA1及Bcl-2的表达同步出现增加，反之亦然。从而证明FoxM1b极有可能作为BRCA1和Bcl-2的上游分子，从而对两者发挥调控作用。综上所述，FoxM1蛋白质在大多数人正常组织中几乎不表达，而在乳腺癌组织中大都高表达。FoxM1三种剪接异构体在乳腺癌组织和细胞中均有一定程度的表达，以FoxM1b最为突出。FoxM1b的高表达与乳腺癌细胞多西紫杉醇耐药密切相关，且能调控BRCA1及Bcl-2的表达。因此FoxM1bmRNA水平表达可能是乳腺癌患者多西紫杉醇耐的一项重要预测因素。剪接异构体FoxM1b通过调控BRCA1及Bcl-2等因子来发挥耐药作用，可作为临床上一个潜在的治疗乳腺癌及逆转多西紫杉醇耐药的新靶点。