人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)为β-疱疹病毒的一种,为双链DNA病毒,具有种属特异性,其在我国人群的潜伏感染率达到90%。HCMV首先感染树突状细胞(dendritic cell,DC)等抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC),但感染后病毒并不能被彻底清除,病毒可潜伏在某些特定的CD34+造血祖细胞内,在其向髓系细胞的分化过程中,潜伏的病毒也被保存下来[1]。当宿主免疫功能低下时,潜伏的病毒可发生再次激活。异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)作为目前治疗血液系统恶性肿瘤的方法已被广泛应用,虽然造血干细胞移植的发展使血液系统恶性肿瘤的生存率有明显提高。但移植后相关并发症仍为影响患者预后的主要因素,由于移植过程应用致死剂量的放化疗且移植后免疫抑制剂的应用而使患者免疫功能显著降低,导致移植后感染的发生率明显增加,且移植早期发生感染会导致较高的致死率[2]。而HCMV作为长期潜伏在人体内的机会致病菌,引起巨细胞病毒感染有很多移植相关危险因素。有研究分析得出清髓性预处理方案,巨细胞病毒感染前发生急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease,aGVHD)为移植后HCMV初次激活的危险因素,而原发病为淋巴瘤或多发性骨髓瘤患者则为移植后连续HCMV感染的危险因素[3,4]。且有研究分析巨细胞病毒感染到巨细胞病毒感染性疾病发生的危险因素,得出最初发生巨细胞病毒感染时CMV拷贝数高,且监测到CMV拷贝数时粒细胞、淋巴细胞缺乏为巨细胞病毒感染发展为巨细胞病毒感染性疾病的危险因素,其中淋巴细胞缺乏可作为独立因素预测巨细胞病毒感染发展为巨细胞病毒感染性疾病的风险[5]。虽然更昔洛韦及膦甲酸钠对控制CMV感染有一定疗效,但抗病毒药物存在明显的骨髓抑制及肾脏损伤,可以延迟患者CMV特异性免疫的恢复,造成迟发型CMV感染的发生,且迟发型CMV感染的病死率较高,可达40%以上[6,7]。随着细胞治疗的发展,抗病毒的细胞治疗成为了研究的热点,而细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)作为抗病毒细胞的主要效应细胞成为了研究的焦点。近几年,各中心探索不同的细胞制备方法,并进行临床试验取得较好疗效。目前制备巨细胞病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法主要为体外培养,利用四聚体筛选,利用IFN-γ筛选等方法。体外培养法多采用树突状细胞为抗原呈递细胞,利用巨细胞病毒抗原负载树突状细胞后,利用成熟的树突状细胞去刺激淋巴细胞获得病毒特异性CTL[8]。四聚体筛选技术,为利用HLA-多肽四聚体及磁珠分选的方法可从供者体内分离针对CMV的特异CTL[9]。但四聚体筛选方法需提前明确患者的HLA的表达,并筛选不同HLA位点识别的肽段。利用γ-干扰素直接从供者外周血分离CTL的方法为采集CMV血清学阳性供者外周血分离单个核细胞,将单个核细胞与pp65抗原孵育,标记抗干扰素抗体,通过免疫磁珠分选阳性细胞,获得cmv特异性ctl[10]。利用ifn-γ筛选虽然无hla限制性,但需要大量供者外周血,且实验成本较高。以上方法均应用供者外周血,有研究表明g-csf动员后的外周血单个核细胞可抑制t淋巴细胞增值,并降低其ifn-γ及il-4的释放[11]。但随后有中心验证可以利用g-csf动员后的外周血制备cmv特异性ctl,且与传统非动员pbmc进行比较,生物学特性无明显差异[12]。通过回顾性分析在本中心自2011年12月至2014年12月行异基因造血干细胞移植患者398例,应用kaplanmeier及logistics回归模型,分析了cmv感染的发生率及其发生的危险因素。经分析得出,398例患者中233例发生cmv感染,累计发生率为58.5%。单因素分析中,hla不全相合、预处理过程中使用抗人免疫球蛋白(anti-humanthymocyteglobulig,atg)、发生急性移植物抗宿主病(acutegraftversushostdisease,agvhd)及激素用量≥1mg/kg泼尼松与cmv感染发生率增加有关。多因素分析中,hla不全相合(hr=2.765,p=0.000)、预处理过程中使用atg(hr=3.866,p=0.000)及激素用量≥1mg/kg泼尼松(hr=4.767,p=0.000)使cmv感染的风险增加。综上所述,供者与患者hla不全相合、预处理过程中应用atg及治疗过程中激素用量≥1mg/kg泼尼松都会增加患者cmv感染的发生率。利用g-csf动员的外周血单个核细胞,通过贴壁法分离树突状细胞及淋巴细胞,并利用覆盖中国人群90%以上巨细胞病毒多肽去负载树突状细胞并激活淋巴细胞,制备cmv-ctl。通过分析细胞表型、细胞内ifn-γ检测及细胞因子分泌的检测来鉴定制备细胞的生物学特性。经分析得出,经培养淋巴细胞数量增多,cd3细胞比例明显增高,经抗原刺激后制备细胞的细胞内ifn-γ分泌增高;细胞因子测定为ifn-γ、tnf-α及颗粒酶分泌相比阴性对照组明显增高。综上所述,经该体系制备的细胞毒性t淋巴细胞具有特异性细胞杀伤活性。自2015年4月至2016年3月,共6例患者在本中心入组临床试验,应用cmv特异性ctl治疗造血干细胞移植后cmv感染。利用上述方法制备的cmv特异性ctl治疗移植后cmv感染,输注细胞数为1×107/m2/次,输注周期为每周一次,直至cmv转阴或连续输注四次仍无效则停止输注。cmv的监测采用q-pcr法,每周两次。经分析得出,患者通过输注cmv特异性ctl无不良反应发生,可以有效控制患者cmv感染。本课题研究结果证明,行异基因造血干细胞移植患者中,供者与患者hla不全相合、预处理过程中应用atg及治疗过程中激素用量≥1mg/kg泼尼松都会增加患者cmv感染的发生率;成功应用g-csf动员后的外周血单个核细胞制备cmv特异性ctl,通过生物学检测验证其特异性杀伤活性;并应用上述制备细胞进行临床试验,试验结果显示cmv特异性ctl输注可以有效控制cmv感染,且无明显不良反应发生。