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动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是严重影响人类健康的心血管疾病之一。动脉粥样硬化的发病机制复杂,近年来研究认为,免疫机制是动脉粥样硬化发生发展的主要病理机制之一,但已有的研究尚难以完全解释其发生的分子机制。在对动脉粥样硬化病因机制的探寻中越来越多的研究报告显示了热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)和HSP70抗体与动脉粥样硬化的相关性。研究发现,在冠心病、动脉粥样硬化和高血压患者的血浆中不仅HSP70水平显著升高,而且发现其抗体的存在;流行病学调查进一步显示,血浆中显著升高的HSP70抗体的浓度与疾病的严重程度具有相关性,这种相关性不受年龄、性别和其他危险因素的影响。这些研究结果表明血浆HSP70升高和HSP70抗体的出现参与了心血管疾病发生发展的病理机制,但动脉粥样硬化形成过程血浆HSP70抗体水平变化及参与动脉粥样硬化发生发展的病理机制并不清楚。为阐明动脉粥样硬化形成过程中血浆HSP70抗体的作用机制,本研究建立大鼠动脉粥样硬化动物模型,认识动脉粥样硬化形成过程中血浆HSP70抗体水平动态变化,探索血浆HSP70抗体在动脉粥样硬化形成过程中产生的机制;并进一步研究血浆HSP70抗体在动脉粥样硬化形成过程中的作用及其生物学机制,为揭示动脉粥样硬化发病机制,探寻动脉粥样硬化防治措施提供新的科学依据。一、动脉粥样硬化形成过程中血浆HSP70抗体水平的变化本研究采用高脂膳食喂养Wistar大鼠10w,以大鼠血脂水平和主动脉病理学观察确认动脉粥样硬化动物模型建立,结果显示,高脂组大鼠高脂膳食2w,大鼠血浆总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)水平较对照组显著升高,且随着动脉粥样硬化的发生发展逐渐升高;而血浆甘油三酯和高密度脂蛋白水平与对照组相比无明显差异。大鼠主动脉病理学检查显示,大鼠高脂膳食10w后血管壁内膜增厚,形成片状或点状钙化的动脉粥样硬化斑块典型病理改变,表明成功建立动脉粥样硬化动物模型。采用ELISA方法检测大鼠动脉粥样硬化形成过程中血浆HSP70抗体水平,结果显示:高脂组大鼠高脂膳食4w,大鼠血浆总HSP70 IgG和IgM抗体水平均显著高于对照组,早于大鼠主动脉出现病理改变时间(6w),并随动脉粥样硬化形成过程逐渐升高; 10w时,高脂组大鼠血浆总IgG、IgG1、IgM水平显著高于对照组和0w,而IgA、IgG2a,IgG2b水平无显著改变。表明动脉粥样硬化形成过程中血浆HSP70抗体水平显著升高,动脉粥样硬化大鼠血浆HSP70抗体亚类水平发生改变。为探索血浆HSP70抗体产生的机制,进一步检测大鼠动脉粥样硬化形成过程中血浆HSP70水平,结果显示,高脂组大鼠高脂膳食2w,大鼠血浆HSP70水平显著高于对照组(0.18±0.021 g/ml vs 0.087±0.014 g/ml),随着动脉粥样硬化发生发展逐渐升高;蛋白免疫印记检测大鼠血浆HSP70复合物水平变化,发现动脉粥样硬化大鼠血浆HSP70复合物种类及含量显著高于对照组,提示血浆HSP70水平升高及血浆HSP70复合物水平变化是血浆HSP70抗体产生的机制之一。二、动脉粥样硬化形成过程中HSP70抗体的作用及其生物学机制为观察血浆HSP70抗体在动脉粥样硬化形成过程中的作用,采用杂交瘤技术研制HSP70单克隆抗体BD091,竞争ELISA方法显示,BD091与血浆HSP70抗体具有相同结合位点。采用抗体尾静脉注射方法给予大鼠HSP70抗体BD091(IgG1,aa 384-642)或SPA-810 (aa 437-504),结果显示:BD091抗体可以诱导大鼠血管损伤,增加动脉粥样硬化脂质斑块面积及斑块内SMCs、MΦ、T细胞数目,提高斑块中细胞间粘附分子-1(ICAM-1)/单核细胞趋化因子(MCP-1)表达水平; SPA-810对动脉粥样硬化形成无显著影响。同时检测大鼠血脂水平,与对照组比较,HSP70抗体处理组大鼠血脂水平未发生显著改变;表明识别HSP70特异性位点的HSP70抗体可以促进动脉粥样硬化形成,这种作用不会改变大鼠血脂水平。OxLDL是动脉粥样硬化发生的危险因素,可以诱导血管内皮细胞HSP70表达水平升高。大鼠动脉粥样硬化形成过程中,大鼠血浆OxLDL水平显著高于对照组,与血浆HSP70抗体水平显著相关。采用20 g/ml OxLDL干预血管内皮细胞12h,使血管内皮细胞HSP70表达水平升高,诱导HSP70定位于细胞膜的HSP70增多。为研究HSP70抗体对血管内皮细胞的损伤作用,给予血管内皮细胞20 g/ml OxLDL 12h,未见细胞培养中LDH水平显著升高;而当再加入HSP70抗体和补体或外周血淋巴细胞后,细胞培养液中LDH水平显著升高;表明HSP70抗体能够诱导血管内皮细胞损伤。为进一步研究血浆HSP70抗体的作用机制,采用改良ELISA方法检测大鼠动脉粥样硬化形成过程中血浆HSP70抗原抗体复合物(HSP70-IC)水平,结果显示,高脂组大鼠高脂膳食8w后血浆HSP70-IC水平较对照组显著升高,且随着疾病的发生发展逐步升高,提示HSP70-IC参与动脉粥样硬化形成过程。应用PEG沉淀法制备HSP70-IC(BD091-IC),采用细胞ELISA方法检测外周血淋巴细胞粘附血管内皮细胞数目,结果显示:HSP70-IC可以粘附于血管内皮细胞,诱导细胞ICAM-1表达水平升高,并增加外周血淋巴细胞粘附血管内皮细胞数目;而单独给予血管内皮细胞BD091或HSP70对外周血淋巴细胞粘附血管内皮细胞无显著影响;表明HSP70-IC可以介导外周血淋巴细胞粘附于血管内皮细胞。为观察HSP70-IC对平滑肌细胞的影响,应用组织块培养法培养大鼠血管平滑肌细胞,采用MTT和流式细胞术方法检测平滑肌细胞增殖水平,结果发现50 g/ml以上浓度HSP70-IC可以诱导平滑肌细胞增殖,增加平滑肌细胞培养液中PDGF-BB、MCP-1水平。应用划痕实验和Boyden Chamber实验观察到HSP70-IC可以诱导平滑肌细胞的迁移。Fcγ受体(FcγRs)是位于细胞膜表面的IC特异性受体。采用荧光实时定量PCR方法检测平滑肌细胞FcγRs表达水平,结果显示,50 g/ml HSP70-IC干预平滑肌细胞6h后,细胞FcγRI、FcγRIII表达水平较对照组显著升高,并随着HSP70-IC干预浓度的提高而升高;而单独给予平滑肌细胞BD091和HSP70未见导致平滑肌细胞FcγRI和FcγRIII表达水平显著变化,表明HSP70-IC可以诱导平滑肌细胞FcγRI和FcγRIII表达;应用蛋白免疫印记方法检测平滑肌细胞NF-κB/ERK通路活化状态,发现50 g/ml HSP70-IC可以诱导平滑肌细NF-κB/ERK通路活化。上述结果提示,HSP70-IC可诱导平滑肌细胞FcγRs表达升高,HSP70-IC与FcγRs相互作用,激活NF-κB/ERK通路,促使平滑肌细胞分泌细胞因子,导致平滑肌细胞增殖与迁移。综上所述,高脂膳食所致大鼠动脉粥样硬化形成过程中,血浆HSP70水平升高和血浆HSP70复合物异常增多导致血浆HSP70抗体产生,并继而诱导大鼠主动脉内皮损伤,增加动脉粥样硬化斑块面积及斑块内浸润细胞数目,提高斑块中炎症因子水平,促进动脉粥样硬化形成;HSP70抗体促进大鼠动脉粥样硬化可能通过诱导血管内皮细胞损伤,与血浆HSP70形成HSP70-IC,并诱导外周血淋巴细胞粘附于血管内皮细胞,促进血管平滑肌细胞增殖与迁移而实现的。