目的：构建pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ表达载体，稳定转染大鼠骨髓间充质干细胞，并验证其在MSCs中的上调表达，建立ChM-Ⅰ稳定上调表达的MSCs细胞株，为进一步开展ChM-Ⅰ诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化，构建组织工程软骨相关研究打下基础。　　 方法：　　 1．用Trizol法提取大鼠软骨组织总RNA，根据ChM-Ⅰ基因序列(序列号：AF051425)设计特异引物，上游引物为：5GCAGACAAGCTTATGACAGAGAACTCGGACA3’，下游引物为：5 GCAGACGCGGCCGCTTACACCATGCCCAAGATG3’，通过PCR获取ChM-Ⅰ目的基因，分别将ChM-Ⅰ目的基因的PCR产物和pcDNA3.1(+)质粒双酶切，并将两者定向连接，构建pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ质粒，转化感受态细菌，挑取阳性单克隆并扩增，酶切鉴定阳性克隆，并对插入的ChM-Ⅰ片段进行测序。　　 2．密度梯度离心法获得大鼠MSCs，传代培养并扩增。使用流式细胞技术检测细胞表面抗原；对大鼠MSCs进行成脂及成骨诱导培养，检测所获得MSCs的潜在分化能力。　　 3．脂质体法将质粒转染进大鼠MSCs。实验分三组：实验组(转染pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ质粒)；对照组(转染pcDNA3.1(+)质粒)；空白组。通过预实验，确定大鼠MSCs的最佳G418筛选浓度为200ug/ml。转染复合体作用6小时后，更换完全培养基，48小时后加入200ug/mlG418筛选培养基，使用筛选培养基持续传代培养并扩增实验组和对照组细胞，以获得稳定转染质粒的大鼠MSCs。　　 4．取稳转后连续培养三代的大鼠MSCs提取总RNA和蛋白质，使用RT-PCR和Western blot分别在RNA和蛋白质水平上检测ChM-Ⅰ在各组大鼠MSCs细胞株内的转录和表达，鉴定所筛选的大鼠MSCs细胞株中ChM-Ⅰ的上调表达及其稳定性。　　 结果：　　 1．对阳性克隆鉴定及测序和序列分析对比，结果显示与ChM-Ⅰ基因长度相符，序列无误，且读码框正确。　　 2．单细胞悬液接种48小时后换液，倒置显微镜观察并拍照，可于培养皿底部见到呈梭形或三角形的贴壁细胞，培养11-13天后培养皿底部细胞密度达到90％以上。细胞传代，在6小时内可达80%以上贴壁，细胞生长速度加快，可见细胞呈成纤维细胞样生长，折光性较强，可呈鱼群样生长。流式细胞仪鉴定结果：MSCs阳性表面抗原CD90、CD29的表达率分别为99.79%、98.41%； MSCs阴性表面抗原CD45、CD11b/c的表达率分别为2.77%、2.51%。成脂诱导2周后，油红0染色，脂滴为橙红色；成骨诱导3周后，茜素红染色，镜下显现为红色斑片。　　 3．转染复合体作用6小时后，可见大量MSCs胞质内出现折光性强的小泡，提示阳离子脂质体已结合质粒进入MSCs。48小时后加入200ug/mlG418筛选培养基5天后空白组出现少量细胞漂浮死亡，实验组和对照组也可见少量细胞死亡。7天后空白组出现大量死亡，14天后空白组细胞全部死亡，两个转染组大约有10%的细胞存活，转染组细胞不再死亡，开始增殖，生长速度逐渐加快。传代后，细胞生长旺盛，排列密集整齐，呈编织状旋涡状。　　 4．RT-PCR结果：采用ChM-Ⅰ/GAPDH灰度比值作为评定指标，实验组、对照组和空白组ChM-Ⅰ/GAPDH灰度比值的平均值分别为1.0817±0.2233、0.3601±0.1260、0.3687±0.0086；实验组与对照组和空白组间具有统计学意义P＜0.05，对照组与空白组间无统计学意义P＞0.05。Western blot结果：采用ChM-Ⅰ/GAPDH灰度比值作为评定指标，实验组、对照组和空白组ChM-Ⅰ/GAPDH灰度比值的平均值分别为0.9867±0.0204、0.4155±0.0206、0.3751±0.0081；实验组与对照组和空白组间具有统计学意义(P＜0.05)，对照组与空白组间无统计学意义(P＞0.05)。结果提示：实验组中的ChM-Ⅰ在mRNA水平和蛋白水平上的表达均明显高于对照组和空白组。　　 结论：　　 成功将pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ质粒转染到大鼠骨髓间充质干细胞中，经过含G418的筛选培养基稳定筛选，最终建立ChM-Ⅰ稳定上调表达的MSCs细胞株，为进一步开展ChM-Ⅰ诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化，构建组织工程软骨相关研究打下基础。