第一章绪论本章旨在介绍本论文相关研究背景,包括脊髓损伤；Keap1-Nrf2-ARE的结构及激活模式；Nrf2的神经保护作用；Nrf2与NF-κB之间的相互关系以及莱菔硫烷的药代动力学。第二章Nrf2-ARE通路激活对大鼠脊髓损伤的神经保护作用脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)继发性损伤常导致氧化应激损伤、炎症反应、线粒体功能丧失的产生,最终导致细胞死亡。核因子E2相关因子2-抗氧化反应元件(nuclear factor E2-related factor 2 antioxidant response element, Nrf2-ARE)通路能有效地调节上述继发性损伤机制。因此,在本研究中我们探讨Nrf2-ARE通路激活是否对大鼠脊髓损伤具有神经保护作用。使用NYU冲击仪制得雌性Fischer大鼠胸段(T8)脊髓中度损伤模型。损伤后,Nrf2蛋白在脊髓组织多种神经细胞(神经元、星形细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞)细胞质内活化、积聚并逐渐向细胞核内转移,并启动ARE调控的保护因子如血红素加氧酶1(heme oxygenasel, HO-1)和谷氨酸半胱氨酸链接酶催化亚单位(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit, GCLC)的表达。莱菔硫烷(Sulforaphane, SFN)作为Nrf2-ARE通路激动剂能有效地提高大鼠脊髓组织中Nrf2及GCLC的含量,同时抑制核因子κB (nuclear factor-KB, NF-κB)的活化以及降低炎症因子如白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)的表达,最终减少脊髓损伤体积并改善大鼠运动协调性。这些结果表明,Nrf2-ARE的激活对大鼠脊髓损伤具有神经保护作用,同时SFN也可作为治疗脊髓损伤的神经保护药物。Ⅲ第三章SFN抑制ATP诱导的NF-κB激活的作用第二章实验研究已经证实,莱菔硫烷(sulforaphane, SFN)可以有效地提高大鼠损伤脊髓组织中核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)及下游保护因子的表达,同时抑制核因子κB (nuclear factor-κB, NF-κB)的激活及下游炎症因子的表达,最终改善大鼠运动功能。然而,Nrf2与NF-κB之间具体的作用机制尚未明确。本章节实验旨在使用原代大鼠神经元培养,明确Nrf2的抗炎作用及Nrf2与NF-κB具体相互作用机制。原代大鼠神经元使用不同浓度SFN (0, 10μM和20μM)预处理2小时,随后加入1mM ATP诱导NF-κB通路的激活。使用蛋白免疫印迹法检测Nrf2及下游因子、炎症因子和phospho-IκBα的含量。结果显示,SFN呈浓度依赖性的提高大鼠神经元中Nrf2及下游保护因子的含量,同时抑制细胞中ATP诱导的Caspase-1、白介素1β(Inteluekin-1β, IL-1β)及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα, TNF-α)的表达；另外,IKBα的磷酸化程度及IL-1β前体(pro-IL-1β)表达也被明显抑制,提示ATP诱导的NF-κB通路被SFN抑制。综上所述,SFN不仅能上调大鼠神经元内Nrf2及下游保护因子的表达,同时抑制ATP诱导的NF-κB活化及下游因子表达。本实验揭示了Nrf2与NF-κB之间复杂的相互作用中一种新的作用机制。第四章Nrf2-ARE在神经元、星形细胞和小胶质细胞损伤后的表达在第二章中,激光共聚焦方法已经证实在大鼠脊髓损伤1天后,核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)能在脊髓前角区域内的神经元、星形细胞、少突胶质细胞以及小胶质细胞中激活。但是,Nrf2-ARE在各种细胞损伤后的表达情况目前还没有研究。在本章中,使用可控性的细胞损伤仪对各种神经细胞进行损伤,然后使用蛋白免疫印迹法测定Nrf2及下游因子在细胞损伤后的蛋白水平,明确Nrf2-ARE通路在各种神经细胞损伤后的表达情况。在神经元中,Nrf2-ARE通路在损伤后15分钟即被激活。在星形细胞中,Nrf2蛋白水平在损伤后随时间推移而逐渐降低,下游因子蛋白水平也未见升高；在小胶质细胞中,Nrf2激活在细胞损伤后1小时出现,晚于在神经元中的激活。这些结果表明,Nrf2-ARE通路在各种神经细胞损伤后的表达各不相同,提示各种神经细胞在组织中的功能及作用各不相同。各种细胞类型中Nrf2-ARE具体的神经保护机制以及各种细胞之间的相互作用值得进一步研究。