论文部分内容阅读
猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible Gastroenteritis virusof swine，TGEV）引起的一种高度接触性的肠道传染性疾病，目前该病尚缺乏有效的治疗药物，疫苗接种便成为预防该病的主要措施之一。本研究利用分子生物学手段，根据GenBank中录入的TGEV全基因组序列，用Oligo6.0软件设计一对引物，以TGEV-RNA为模板，利用RT-PCR扩增其N基因并进行克隆。将原核表达载体pET-32a(+)与目的基因分别双酶切，连接转化，筛选阳性质粒，并命名为pET-32a(+)-N。将阳性重组质粒pET-32a(+)-N转化到大肠杆菌（Escherichia coli）BL21中，在IPTG终浓度0.1mmol/L和37℃条件下诱导，外源基因获得高效表达。利用一站式His标记蛋白质微量纯化套装纯化TGEV-N蛋白，获得纯化的重组N蛋白。以纯化的TGEV重组N蛋白作为包被抗原，建立了检测猪传染性胃肠炎抗体的间接ELISA方法。确定了抗原最佳包被浓度为10μg/mL，抗体稀释度为1:40，封闭液和抗体稀释液为含10%犊牛血清的PBST，酶标二抗的浓度为1:40000。与Svanova TGEV/PRCV抗体诊断试剂盒比较，两者的总符合率为75%。利用纯化的TGEV重组N蛋白免疫Balb/c小鼠，按常规方法进行融合，经间接ELISA方法筛选，采用有限稀释法进行3次克隆筛选，获得了3株（分别命名为1-27，2-7，2-15）特异性好并能稳定分泌抗TGEV-N蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，获得腹水即为单克隆抗体，间接ELISA检测其效价均为10~6；这3株单抗的亚类均为IgG1；在间接免疫荧光试验中，3株单抗均仅能与TGEV感染细胞反应，呈现细胞胞浆以及胞膜的特异性亮绿色荧光，而与感染的PCV2、PRV和PRRSV的细胞未出现荧光，均为阴性；免疫印迹分析结果显示，3株单抗均能识别TGEV的同一条带，与预期蛋白（43.5KDa）大小一致。结论：（1）获得了纯化的重组TGEV-N蛋白；（2）以纯化的的重组TGEV-N蛋白为包被抗原建立了检测TGE抗体的间接ELISA方法；（3）获得并制备了3株抗TGEV-N蛋白的单克隆抗体。这些结果为进一步开展TGEV的免疫学诊断方法奠定了基础。