TUDCA通过抑制凋亡干预新生小鼠坏死性小肠结肠炎机制的初步研究

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【目的】评价内质网应激抑制剂牛磺熊脱氧胆酸(Tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)对新生小鼠坏死性小肠结肠炎模型的保护作用,并探讨TUDCA对小肠上皮细胞和潘氏细胞的保护作用及其可能的机制。【方法】采用人工喂养联合缺氧及冷刺激方法制备7-10日龄C57BL/6J新生小鼠NEC模型。实验分为四组:正常对照组(10只),NEC模型组(14只),TUDCA干预正常对照组(10只)以及NEC模型TUDCA干预组(16只)。比较四组间体重改变、生存率及病理改变,酶联免疫吸附法检测血清炎症因子IL-1β和IL-6的水平;荧光实时定量PCR检测IL-1β和IL-6 mRNA的水平。Western blot检测小鼠肠道组织BiP、p-PERK、p-eIF2α、CHOP蛋白表达水平。免疫荧光检测小鼠和人肠道BiP的表达,Tunel检测小鼠肠道组织的凋亡。进一步体外实验中以IEC-6细胞为研究对象,分为五个组:对照组,LPS(50μg/ml)处理组,LPS和TUDCA(50μM、100μM、200μM)共同处理三个浓0度梯度组。LDH释放实验检测TUDCA对细胞的毒性,流式和Tunel检测IEC-6细胞的凋亡。免疫荧光检测BiP的表达。Western blot检测BiP、p-PERK、p-eIF2α、CHOP蛋白表达水平。收集NEC患儿外科手术小肠标本12例,胎龄和手术年龄匹配的对照组标本10例。采用免疫组化方法对潘氏细胞进行计数。采用免疫组化方法检测潘氏细胞抗菌肽(溶菌酶(Lysozyme),α-防御素5(HD-5),分泌型磷脂酶A2(sPLA2)等)的表达情况。采用实时荧光定量PCR技术检测潘氏细胞抗菌肽的RNA的表达。肠道组织Lysozyme和BiP,HD-5和Tunel免疫荧光共定位染色检测。免疫组化检测小鼠肠道组织Lysozyme的表达及潘氏细胞计数;肠道组织Lysozyme和BiP,Lysozyme和Tunel免疫荧光共定位染色检测;荧光实时定量PCR检测抗菌肽Lysozyme、DEFA3、DEFA5mRNA水平。【结果】TUDCA能够改善新生小鼠的NEC疾病的严重程度,维持NEC模型小鼠的体重,提高生存率。其次,TUDCA能够降低血清和肠壁中的炎症因子IL-1β和IL-6的表达并且能够抑制小鼠小肠上皮细胞的凋亡并降低肠道组织内质网应激标志物BiP、p-PERK、p-eIF2α、CHOP的表达(P<0.05)。由于人和小鼠NEC组小肠绒毛和隐窝部位内质网应激的小肠上皮细胞均增加。体外实验中进一步发现,TUDCA能够抑制IEC-6细胞的凋亡,降低IEC-6细胞的内质网应激标志物BiP、p-PERK、p-eIF2α、CHOP的表达(P<0.05)。在人的临床标本中,与对照组相比,NEC组潘氏细胞分泌的Lysozyme,HD-5,sPLA2均降低(P<0.05)。NEC患儿肠道标本的潘氏细胞数目较对照组减少(P<0.05)。NEC组潘氏细胞的内质网应激标志物BiP和凋亡增加。在小鼠肠道标本中,NEC组潘氏细胞数目及其分泌的Lysozyme蛋白和Lysozyme、DEFA3、DEFA5 mRNA水平降低,TUDCA干预后能够恢复潘氏细胞及其分泌的抗菌肽表达增加。NEC组潘氏细胞内质网应激标志物BiP表达以及凋亡增加、、、、、,TUDCA干预后能够降低潘氏细胞的BiP的表达和改善凋亡。【结论】腹腔注射TUDCA可以维持NEC模型新生小鼠的体重,改善改善肠道损伤,抑制肠道炎症。其机制可能与抑制PERK-eIF2α通路改善小鼠上皮细胞的内质网应激和凋亡、保护潘氏细胞的免受内质网应激和凋亡的影响有关。
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