机体通过胃肠道摄取食物、消化食物为小分子营养物质、吸收营养物质并最终将食物残渣排出体外,胃肠道的运动功能是胃肠道功能的重要组成部分,在食物的消化及残渣排空过程中适时地将内容物向前推进。生理状态下,胃肠道运动是在肠神经系统(Enteric nervous system,ENS)复杂而严密的调控之下,由起搏细胞Cajal间质细胞(Interstitial cells of Cajal,ICC)、效应细胞平滑肌细胞(Smooth muscle cells,SMC)等共同协调完成,具有相对独立性,同时接受来自中枢神经系统(Centralnervous system,CNS)外来神经纤维的调节;期间多种神经内分泌介质如5-羟色胺、乙酰胆碱、缩胆囊素等也参与胃肠运动的调节。ENS是分布于消化道管壁内的内在神经网络,按神经元胞体聚集的位置可分为肌间神经丛和粘膜下神经丛,其中位于纵行肌与环形肌之间的肌间神经丛在调节胃肠道运动中发挥重要作用。ICC是一类分布于ENS与SMC之间的一类特殊细胞,目前研究认为ICC作为起搏细胞不仅可以自发产生节律性的慢波,而且可介导ENS与胃肠道SMC之间的信号传导,在胃肠道动力的产生与维持中起着重要的作用。简而言之,分布在肠壁的ENS感受肠内容物的机械刺激及化学刺激,通过中间神经元传递到肌间神经丛,引起兴奋性信号的增加及抑制性信号的减少,经过ICC尤其是位于纵行肌及环形肌之间的ICC-MY综合到慢波,最终产生SMC协调性的收缩与舒张,将肠内容物向前推进。ENS 由肠神经崤细胞(Enteric neural crest-derived cells,ENCDC)发育形成,随着胚胎的逐渐发育,ENCDC沿原始消化管迁移、定殖并分化成为众多不同亚型的肠神经细胞,最终发育为成熟的ENS。ENCDC迁移分化是一个耗时而且复杂的过程,受多种基因及肠道微环境因素的严密调控,如果ENS发育过程中出现异常将最终导致肠神经元发育异常性疾病(Neuronal intestinal malformations,NIM)。临床上常见的肠道疾病先天性巨结肠(Hirschsprung’s disease,HSCR)以及过去称作巨结肠类缘病之一的肠神经元发育不良(Intestinal neuronal dysplasia,IND)均是NIM的常见类型,具有严重的结肠动力障碍,目前认为是ENS发育异常的不同结局,同时也有报道显示合并存在肠道微环境及ICC的异常,其病因尚未完全阐明,明确诊断主要依赖于组织病理学诊断,增加了临床诊治工作中的困难与不便,也要求我们对其发病机制进行进一步的研究从而为临床工作提供理论依据。本次研究共分为2个部分,第一部分为:Neurexin1基因与Neuroliginl基因在肠神经元发育不良动物模型中的表达及其对结肠动力的影响;第二部分为:层黏连蛋白Laminin在先天性巨结肠的表达及对Cajal间质细胞的影响。第一部分Neurexin1基因与Neuroligin1基因在肠神经元发育不良动物模型中的表达及其对结肠动力的影响研究背景及目的Neurexins是一类表达于突触前膜的神经表面粘附蛋白,与其突触后配体Neuroligins相互作用,在诱导CNS兴奋性谷氨酸能与抑制性y-GABA能神经突触的发生、分化、功能维持及平衡中起重要作用。前期研究发现:Neurexins与Neuroligins亦表达于ENS肌间神经丛,且表达量随胚胎发育逐渐增加,与ENS发育具有时间相关性提示其可能参与ENS的发育过程;在HSCR病变肠段Neurexins与Neuroligins表达明显降低,患儿血清中相关神经递质同时存在异常,表现为血清谷氨酸含量的降低及y-GABA含量的升高,可能是HSCR受累肠段结肠动力障碍的原因之一。胃肠运动同样依赖于兴奋性信号与抑制性信号的协调与平衡,基于Neurexin、Neuroligin基因在ENS的表达及其在诱导突触形成方面的重要作用,我们提出Neurexin与Neuroligin基因可通过控制突触的形成影响肠道的运动功能的假设。IND为巨结肠类缘病(Hirschsprung’s allied disease,HAD)的一种,以粘膜下神经丛及肌间神经丛增生、巨神经节、异位神经节等为特征性病理表现,虽然病理特征不同于HSCR表现为病变肠管神经节细胞缺如,然而临床表现却与HSCR非常类似,均存在严重的结肠动力障碍。IND可单独存在,也可合并存在于HSCR无神经节细胞段近端的肠管,是HSCR术后仍表现出便秘及功能性肠梗阻的常见原因之一。目前对于IND是否是一类独立的疾病虽然仍存在争议,但动物模型是其作为独立疾病存在的强有力的证据,Tlx2基因敲除(Tlx2-/-)小鼠表现出肠道肌间神经丛的增生,与人类IND非常相似,是目前研究IND重要的动物模型。研究证实,Neuroliginl主要表达于谷氨酸能神经突触,与Neurexins相互作用,通过募集突触相关蛋白及受体诱导谷氨酸能突触的生成。基于以上论述及假设,在本次研究中将以Neurexinl与Neuroliginl作为目的基因,以Tlx2-/-小鼠为动物模型,进一步研究Neurexin1、Neuroligin1基因及相关的谷氨酸能突触在IND动物模型中的表达变化,探讨其对结肠动力的影响。研究方法1、通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得Tlx2基因敲除杂合子(Tlx2+/-)小鼠,Tlx2+/-小鼠间杂交繁殖,子代小鼠采用Southern-blot及基因测序进行基因型鉴定,获得Tlx2基因敲除纯合子(Tlx2-/-)小鼠。选择8周龄雄性野生型(Wild type,WT)、Tlx2+/-及STlx2-/-小鼠,采用玻璃球技术对不同基因型小鼠结肠动力进行测定,将玻璃球逆行放置在距离肛门2cm结肠,以玻璃球排出需要的时间代表结肠排空时间;戊巴比妥钠麻醉小鼠后,心脏取血获取小鼠血液标本,解剖后获取距离回盲部1.5cm远端结肠全层标本。2、运用免疫组织化学染色,检测蛋白Neurexin1、Neuroligin1以及谷氨酸能突触前标志物谷氨酸囊泡转运体-1(Vesicular glutamate transporter-1,VGLUT1)与谷氨酸能神经元N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体NR1在不同基因型小鼠结肠的表达部位;采用Western-blot及qRT-PCR检测Neurexin1、Neuroligin1、VGLUT1及NR1在不同基因型小鼠结肠的表达并进行相对定量分析;采用ELISA方法检测血清中谷氨酸的含量。3、将8周龄雄性Tlx2-/-小鼠随机分为5组,按0.1mg/Kg通过灌胃(HIG组)及保留灌肠(HRE组)两种途径对Tlx2-/-小鼠进行石杉碱甲药物干预,同时通过灌胃(SIG组)及保留灌肠(SRE组)给予等剂量的生理盐水作为对照,CON组不做任何处理,药物干预持续8周时间。4.干预结束后按前述方法对不同分组Tlx2-/-小鼠结肠动力进行测定、获取小鼠血液标本及距离回盲部1.5cm远端结肠标本;通过Western-blot及qRT-PCR实验技术检测Neurexin1、Neuroligin1及VGLUTI、NR1在不同分组小鼠结肠的表达,通过ELISA实验对不同分组小鼠血清中谷氨酸的含量进行测定,比较不同分组之间有无变化。实验结果1、通过Southern-blot及基因测序证实位于Tlx2基因第二个外显子长度为173bp碱基序列被敲除;Tlx2+/-与WT小鼠相比无明显差异,Tlx2-/-小鼠体重小(P<0.05),发育相对迟缓,并出现不同程度的腹胀,截至8周龄26%(33/127)雄性Tlx2-/-小鼠死亡;大体解剖发现Tlx2-/-小鼠末端回肠、盲肠、及近端结肠扩张,远端结肠呈现收缩状态。2、免疫组织化学染色显示Tlx2-/-小鼠肌间神经丛增生,蛋白Neurexin1、Neuroligin1同谷氨酸能突触标记物VGLUTI、NR1均主要表达于结肠ENS肌间神经丛;Western-blot 及 qRT-PCR 实验结果显示Tlx2-/-小鼠 Neurexin1、Neuroligin1基因在结肠表达较WT及Tlx2+/-小鼠明显升高(P<0.05),VGLUTI、NR1表达趋势同Neurexin1、Neuroligin1基因一致(P<0.05);并伴随有血清谷氨酸含量的升高(P<0.05);同时,TIx2-/-小鼠在结肠动力检测试验中表现出玻璃球排出时间明显延长,提示其存在结肠动力障碍(P<0.05);Tlx2+/-小鼠与WT小鼠之间比较无明显差异。3、使用石杉碱甲对Tlx2-/-小鼠进行干预后,同对照组SIG、SRE组及CON组比较,Western-blot 及 qRT-PCR 实验中 HIG、HRE 组 Tlx2-/-小鼠结肠 Neurexin 1、Neuroligin1表达下降(P<0.05),谷氨酸能突触标记物VGLUT1及NRI表达量也随之降低(P<0.05);并且伴随着血清中谷氨酸含量的下降(P<0.05);同时,在结肠动力检测中HIG与HRE组Tlx2-/-小鼠表现出玻璃球排出时间缩短,提示其结肠动力改善(P<0.05);不同给药途径HIG组与HRE组之间比较无统计学意义。实验结论1、Neurexinl、Neuroligin1与结肠动力相关,谷氨酸能突触在结肠ENS中存在并随 Neurexin1、Neuroligin1 表达的变化而变化,提示 Neurexin1、Neuroligin1对结肠动力的影响可能通过其对结肠谷氨酸能突触的调节作用实现;2、血清谷氨酸含量的变化与结肠谷氨酸能突触及结肠动力的变化一致,可能是反映肠道谷氨酸能突触及结肠动力潜在的辅助性检查指标;3、Neurexin1、Neuroligin1基因可能是石杉碱甲的潜在作用靶点。第二部分层黏连蛋白Laminin在先天性巨结肠的表达及对Cajal间质细胞的影响研究背景及目的HSCR以肠壁ENS神经节细胞缺如为主要病理特征,发病率大约为1/5000,仅次于先天性肛门直肠畸形,是儿童第二位的先天性肠道发育畸形,病变肠段因神经节细胞缺如而导致严重的结肠动力障碍,以胎便排出延迟、顽固性便秘、功能性肠梗阻等为主要临床表现。尽管经肛门巨结肠根治术、Soave、Duhamel等多种手术方式已经在临床广泛应用多年并取得良好的治疗效果,然而其发病机制仍然未完全阐明。目前关于HSCR的发病机制主要有“基因异常学说”及“肠壁微环境学说”,但均不能解释所有的HSCR病例,其发病机制仍然需要进一步研究。ICC是一类分布于SMC之间的特殊细胞,具有基底膜成分,在空间上呈现三维网络结构。ICC不仅与SMC之间存在的广泛的缝隙连接使ICC与SMC在电生理上耦联在一起形成多细胞功能复合体,同时也与ENS神经纤维膨体存在密切联系形成“类突触样”的结构。作为起搏细胞,ICC在胃肠道动力的产生与维持中起着重要的作用,ICC不仅可以自发产生节律性的慢波电位并将其传递到SMC引起节律性的收缩,而且可以将ENS运动神经元兴奋性及抑制性神经冲动整合到慢波,以调节胃肠运动。ICC功能异常将导致严重的胃肠道动力障碍性疾病,如胃瘫、便秘、贲门失弛缓症等。有研究显示,在HSCR受累肠段ICC数量减少及结构异常,并可能与其预后有一定的关系,然而是由何种原因导致的目前尚不清晰。细胞外基质(Extracellularmatrix,ECM)是重要的肠壁微环境因素,Laminin是ECM的重要组分,在细胞的粘附、迁移、分化、形态维持及抑制细胞凋亡方面起到重要作用。研究显示胚胎时期Laminin异常聚集可能导致ENCDC在正常的迁移之前过早的分化、定植而不能到达结肠远端从而导致HSCR远端肠管神经节细胞缺如,但同样受到ECM影响由ENCDC迁移、分化而成的盆腔神经丛却正常,同时也有报道显示Laminin可促进ENCDC的迁移及促进神经细胞的发育,Laminin在参与HSCR的发病机制是否存在其他的作用途径以及在ENCDC移行完成之后是否仍然发挥重要生理作用仍然需要进一步研究证实。由于ICC是一类具有基底膜的间质细胞,因而在本次研究中将肠壁微环境因素与ICC相结合,研究Laminin在HSCR肠壁中的表达及对ICC的影响,进一步阐述HSCR的发病机制。研究方法1、自2017年6月至2019年6月,累计收集HSCR血清及结肠标本48例,同期收集腹股沟斜疝血清标本48例作为对照组,所有病例均来自山东大学齐鲁医院小儿外科住院病人,HSCR病例均经过术后病理诊断证实。2、结肠标本分别从HSCR患儿手术切除结肠狭窄段、移行段、扩张段及正常段获取,为减少肥大细胞对实验的干扰,解剖显微镜下将结肠标本粘膜层剥离,保留浆肌层并分为三份;一份甲醛固定后常规石蜡包埋切片,以c-Kit抗体作为ICC细胞标记与Laminin进行双重免疫荧光染色,观察其在不同节段肠壁中的表达及定位关系;一份进行全层组织免疫荧光,通过共聚焦显微镜扫描,观察ICC的三维结构在各肠段结肠标本中有无异常;剩余的通过Westem-blot及qRT-PCR对Laminin及c-Kit在结肠浆肌层标本中的表达进行半定量分析。3、血清标本在患儿入院后行常规血液学检查时采集,待血液凝固后离心收集上层血清,通过ELISA实验检测HSCR及对照组患儿血清中Laminin及c-Kit表达。4、取胚胎第18天Wistar大鼠孕鼠肠管,采用酶解法分离ICC并通过磁珠分选(Immunomagnetic sorting,MACS)对ICC进行富集,通过细胞免疫荧光染色对分选细胞进行鉴定;通过siRNA转染沉默Laminin表达或加入不同浓度(LN1组:10ug/ml;LN2组:20ug/ml)的外源性大鼠Laminin蛋白对ICC进行干预,干预完成后通过Westem-blot及qRT-PCR实验检测Laminin对ICC细胞c-Kit的表达影响,并进一步采用MTT实验与TUNEL染色研究Laminin对ICC细胞活性及凋亡的影响。实验结果1、石蜡切片双重免疫荧光染色结果显示,Laminin及c-Kit染色在肌层内部及肌间均可见阳性染色,c-Kit染色标记的ICC周围可见Laminin包饶,部分部位染色标记相互重叠,提示Laminin与ICC之间可能存在相互作用;与正常段相比,在HSCR狭窄段标本中,Laminin表达明显降低,位于纵行肌与环形肌间的ICC(ICC-MY)以及肌层内部ICC(ICC-IM)也均明显减少;移行段、扩张段表达相对减少。全层组织免疫荧光染色显示,ICC-MY呈网格状结构,ICC-IM呈类平行状结构,在HSCR狭窄段可见ICC数量明显减少并伴有空间结构的严重破坏;移行段、扩张段表达相对减少,组织结构的破坏相对较轻。Western-blot及qRT-PCR结果与免疫荧光结果一致,Laminin及c-Kit在HSCR狭窄段的表达最低,移行段、扩张段次之,正常段最高(P<0.05)。2、经过ELISA检测,遗憾的是HSCR患儿血清中Laminin及c-Kit的表达与对照组腹股沟斜疝患儿比较没有统计学差异。3、经酶解法分离及免疫磁珠富集后,所提取细胞ICC标记物c-Kit表达阳性,平滑肌标记物平滑肌肌动蛋白(Smooth muscle actin,SMA)表达阴性。Western-blot及qRT-PCR实验结果显示外源性大鼠Laminin蛋白可以上调c-Kit的表达,高浓度的LN2组较低浓度的LN1组上调更加明显(P<0.05);经过siRNA沉默ICC细胞Laminin表达之后,c-Kit的表达也相应的下降(P<0.05)。MTT结果显示,通过siRNA沉默Laminin表达后ICC表现出更严重的细胞活性的下降,而加入外源性的大鼠Laminin蛋白后可以抑制ICC细胞活性的降低,对ICC细胞活性的下降的抑制作用同样具有剂量依赖性,在高浓度LN2组Laminin对ICC细胞活性下降的抑制作用较低浓度的LN1组更明显(P<0.05)。TUNEL染色实验结果显示,通过siRNA沉默Laminin后ICC细胞凋亡增加,而加入外源性大鼠Laminin蛋白可抑制TNF-α导致的细胞凋亡。实验结论1、在HSCR患儿病变肠段Laminin表达降低的同时伴有ICC数量减少以及正常结构的破坏;2、Laminin可维持ICC细胞c-Kit的表达及细胞活性,并抑制其细胞凋亡;3、HSCR患儿病变肠段ICC的异常可能由Laminin表达降低所介导,继而导致受累肠段起搏功能异常而最终表现出结肠动力障碍,可能参与HSCR的发病。