研究背景：　　胰腺癌(Pancreatic cancer)是常见的消化道恶性肿瘤之一，常见组织类型为胰腺导管细胞癌（PDAC），据最新数据统计显示2015年我国新发胰腺癌病达9万例，居消化道恶性肿瘤发病率第五位，恶性肿瘤死因的第五位[1]。因为缺乏早期诊断，其5年生存率仅为4％，是美国第四大致死性肿瘤[2-3]。因此对于胰腺癌发生的机制研究显得至关重要。肿瘤是一类复杂性疾病，在肿瘤发生发展中，肿瘤逐步获得了包括6个生物学能力在内的标志性特征及潜在两个新发现的标志性特征，其中包括细胞能量代谢的重编程[4]。当然亦有研究表明线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）功能对于肿瘤进程起着重要作用,该观点认为线粒体功能改变的逆向信号分子（如ROS,ATP等）能逆向调控核基因表达下的信号转导通路蛋白，从而促进肿瘤的发生[5]。众所周知，线粒体作为细胞能量代谢中心，其功能的改变必然会参与到肿瘤细胞能量代谢的重编程的过程当中，而线粒体功能的维持依赖于其自身一套独立的质量控制系统[6]。本课题以质量控制系统中一重要蛋白分子Hsp60作为研究对象，通过研究Hsp60在胰腺癌发生过程中的作用及其机制，继而了解线粒体功能改变与胰腺癌发生的作用机制。因此本课题首先从胰腺癌组织以及各胰腺癌细胞系中发现Hsp60蛋白呈现高表达水平，随后通过在敲低Hsp60蛋白表达的胰腺癌细胞模型中验证线粒体功能的变化，我们发现低表达Hsp60后细胞线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）水平显著降低，同时癌细胞增殖迁移能力等显著降低。随后我们发现并验证了OXPHOS水平的降低导致Erk1/2磷酸化水平的降低，而这一磷酸化的降低是由ATP生成水平降低直接导致。这一结果使得我们认为线粒体OXPHOS功能的改变逆向调控特定核基因信号转导蛋白表达，继而影响肿瘤的发生。这一发现对于明确OXPHOS水平与胰腺癌发生的确切关系显得尤为重要，同时对于Hsp60蛋白作为一潜在胰腺癌生物学标志物提供了研究基础。　　目的:　　1.为了研究线粒体OXPHOS与胰腺癌发生的关系，我们首先分析了影响氧化磷酸化水平至关重要的蛋白分子Hsp60与胰腺癌的关系，从组织水平和细胞水平两个方面对其进行评价。　　2.为了明确Hsp60是否确实影响胰腺癌发生进程，我们分析了Hsp60蛋白敲低的胰腺癌细胞（Panc-1）其在体内、体外生物学功能的变化。　　3.为明确Hsp60是通过何种机制影响胰腺癌的发生，我们分析了Hsp60蛋白敲低的胰腺癌细胞系(Panc-1)中OXPHOS的水平。一方面确定Hsp60表达与线粒体OXPHOS水平的确切关系，另一方面探讨是否通过OXPHOS水平的改变影响胰腺癌的发生。　　4.为进一步明确 OXPHOS水平与胰腺癌发生关系，我们对正常胰腺及癌细胞的OXPHOS水平进行检测。　　5.为了明确由Hsp60导致的OXPHOS水平的变化是通过何种逆向调控机制影响胰腺癌的发生，我们对细胞生长增殖重要的信号转导通路蛋白表达水平进行分析，从中发现差异表达信号蛋白，寻找可能致癌机制。　　6.为明确线粒体OXPHOS水平降低导致该通路蛋白表达差异，我们通过EB诱导胰腺癌细胞（Panc-1）OXPHOS缺陷模型，检测该通路蛋白的变化。　　7.为进一步明确OXPHOS何种逆向信号分子（ROS,ATP等）的改变逆向调控了该信号转导通路蛋白表达，我们通过各复合体抑（Roteone,Oligomycin,FCCP）处理胰腺癌细胞（Panc-1）及其给予ATP，NAC处理Hsp60蛋白敲低的胰腺癌细胞（Panc-1），检测该通路蛋白表达水平变化。　　8.为进一步验证差异表达信号分子是否参与胰腺癌发生机制中，我们对该信号分子在正常胰腺及癌细胞中表达水平进行检测。　　方法:　　1.分别通过免疫组织化学技术和 SDS-PAGE技术检测胰腺癌组织以及癌旁组织中Hsp60蛋白表达水平，以明确Hsp60表达水平与胰腺癌发生的关系。　　2.通过SDS-PAGE技术检测人源胰腺正常细胞（HPDE6c7）以及细胞胰腺癌细胞系（SW1990,Patu-8988,Panc-1）中Hsp60蛋白的表达水平。　　3.选取一株人源胰腺癌细胞（Panc-1），通过RNAi干扰技术对其Hsp60蛋白进行敲低表达。　　4.通过 CCK-8细胞活性、细胞平板克隆、细胞划痕实验，Transwell小室迁移和侵袭实验等体外实验以及裸鼠体内成瘤实验检测Hsp60蛋白敲低后对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响进行分析。　　5.通过BN-PAGE技术、氧耗能力（OCR）检测技术、ATP生成检测技术、ROS生成对Hsp60蛋白敲低的Panc-1细胞OXPHOS水平进行检测。　　6.通过BN-PAGE技术和氧耗能力（OCR）检测技术对人源胰腺正常细胞（HPDE6c7）以及胰腺癌细胞系（SW1990,Patu-8988,Panc-1）的超级复合体表达情况和氧耗能力进行检测。　　7.通过SDS-PAGE技术对细胞生长增殖重要的信号通路蛋白（P38,JNK,Erk1/2, AMPK,AKT等）在Hsp60蛋白敲低的Panc-1细胞中表达水平进行分析　　8.通过给予EB药物不同时间的处理，利用SDS-PAGE检测上述差异信号通路蛋白表达水平。　　9.通过SDS-PAGE技术，利用Roteone,Oligomycin,FCCP药物处理Panc-1细胞以及给予ATP和NAC处理Hsp60蛋白敲低的Panc-1细胞，检测上述差异信号通路蛋白表达水平。　　10.通过SDS-PAGE技术，检测各人源胰腺正常细胞（HPDE6c7）以及细胞胰腺癌细胞系（SW1990,Patu-8988,Panc-1）中上述差异信号通路蛋白表达水平。　　11.统计学分析：应用SPSS19.0软件分析细胞之间复合体表达量和线粒体功能的差异。　　结果:　　1.通过免疫组织化学技术和SDS-PAGE检测胰腺癌组织以及癌旁组织Hsp60蛋白表达水平，发现Hsp60蛋白表达在胰腺癌组织中呈高表达水平，具有显著性差异。　　2.查阅文献，确定本课题所用人源胰腺正常及癌细胞(HPDE6c7,SW1990,Patu-8988,Panc-1）　　3.通过 SDS-PAGE技术检测到在胰腺癌细胞系中 Hsp60蛋白表达水平呈高表达水平　　4.选取其中一株胰腺癌细胞Panc-1作为后续验证实验的细胞模型，将其Hsp60蛋白敲低后，发现癌细胞在体外生长增殖能力、迁移和侵袭能力均显著下降，在体内成瘤能力减弱。　　5.通过BN/SDS-PAGE技术、氧耗能力检测、ATP及ROS生成实验对其OXPHOS水平进行检测，发现超级复合体表达水平下降，OCR值下降，ATP生成能力下降，ROS生成增高。　　6.通过 BN/SDS-PAGE技术和氧耗能力检测正常胰腺细胞和癌细胞的OXPHOS水平，发现在胰腺癌细胞系中超级复合体表达量以及OCR值均较正常胰腺细胞高，具有显著性差异。　　7.我们对一系列信号分子（P38,JNK,Erk1/2,AMPKa,AKT等）进行检测，结果表明Panc-1细胞Hsp60蛋白敲低后，其Erk1/2磷酸化水平降低，而其他信号分子却并未明显改变。　　8.在给予EB药物处理Panc-1细胞后，随着处理时间延长，Erk1/2磷酸化水平逐步降低。　　9.给予Rotenone，Oligomycin药物处理Panc-1细胞后，其Erk1/2磷酸化水平降低，而FCCP处理后磷酸化水平未发生明显改变，同时给予Oligomycin和FCCP处理后其磷酸化水平也下降。　　10.给予ATP处理Hsp60蛋白敲低的Panc-1细胞后，其Erk1/2磷酸化增高，然而NAC处理却未发生明显变化。　　11.通过SDS-PAGE检测HPDE6c7,SW1990,Patu-8988,Panc-1细胞中Erk1/2磷酸化水平，发现在癌细胞系中，Erk1/2磷酸化水平增高。　　结论:　　1.由免疫组织化学技术和SDS-PAGE在胰腺癌组织中检测Hsp60蛋白高表达水平表明 Hsp60蛋白参与胰腺癌发生的进程当中，而在各人源胰腺癌细胞系中Hsp60高表达水平则进一步表明该结论。　　2.将Hsp60蛋白敲低后Panc-1细胞，其细胞生长增殖能力、迁移和侵袭能力均下降，癌细胞生物学特性降低，说明Hsp60对促进胰腺癌发生具有直接关系。　　3.在Hsp60蛋白敲低的Panc-1细胞中，其超级复合体表达水平下降，OCR值下降，ATP生成能力下降，ROS生成增高，说明Hsp60蛋白对于维持线粒体OXPHOS功能起着重要作用。　　4.根据 BN/SDS-PAGE技术和氧耗能力检测到 HPDE6c7，SW1990，Patu-8988， Panc-1细胞中癌细胞系的超级复合体表达量以及 OCR值均较正常胰腺细胞高，表明胰腺癌细胞较高的线粒体OXPHOS水平促进了胰腺癌的发生。　　5.通过对生长增殖信号通路蛋白的检测发现，在Hsp60蛋白敲低的Panc-1细胞中，Erk1/2磷酸化水平下降，同时在给予不同时间EB处理Panc-1细胞后， Erk1/2磷酸化水平也发生下降，该结果表明线粒体 OXPHOS水平的下降或缺陷介导Erk1/2磷酸化水平下降导致癌细胞生物学特性降低。与此同时在癌细胞系中Erk1/2磷酸化水平升高也验证了这一结论。　　6.在给予Rotene，Oligomycin药物处理Panc-1细胞后，其Erk1/2磷酸化水平降低，而FCCP处理后磷酸化水平未发生明显改变，同时给予Oligomycin和FCCP处理后其磷酸化水平也下降。该结果说明由OXPHOS水平降低引起Erk1/2磷酸化降低是由于ATP生成降低所导致，而给予ATP处理Hsp60蛋白敲低的Panc-1细胞后，其Erk1/2磷酸化回复性升高，然而NAC处理却未发生明显变化，这一结果进一步说明 ATP生成水平的降低导致 ERK1/磷酸化水平的降低，而非ROS和MMP。