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大叶蛇葡萄(Ampelopsis megalophylla Diels et Gilg)又称大叶山葡萄,是我国湖北省恩施地区一种具特色的药用植物,其嫩叶及嫩茎的加工品在当地被称为“霉茶”。目前大叶蛇葡萄的药用资源主要来源于野生,不同来源的大叶蛇葡萄品质存在着一定的差异。众所周知,药用植物资源品质的优劣与其积累的活性次生代谢产物有着直接关系。因此,为了从源头控制其资源品质,需从分子生物学角度阐明活性成分的生物合成途径。目前有关大叶蛇葡萄主要活性成分生物合成关键酶基因的克隆及功能鉴定研究未见报道。本论文基于课题组前期建立的大叶蛇葡萄的转录组数据库,筛选了大叶蛇葡萄活性成分黄酮类化合物生物合成的关键基因,拟克隆编码大叶蛇葡萄类黄酮-3’,5’-羟化酶(F3’,5’H)、无色花色素还原酶(LAR)、黄酮醇-3-羟化酶(F3H)的基因以及进行关键基因F3’,5’H的功能鉴定,以期为大叶蛇葡萄活性成分生物合成分子机制的阐明,以及将来进一步从基因组水平改良大叶蛇葡萄药用植物资源品质提供依据。具体研究内容及结果如下:(1)本论文在前期研究基础上,以大叶蛇葡萄嫩叶为实验材料,通过RT-PCR技术克隆了F3’,5’H、F3H、LAR基因,基因全长分别1931bp、1318 bp、1267 bp。多序列比对发现F3’,5’H氨基酸序列具有高度保守的PPGP、AGTDT、FGAGRRICAG结构域,F3H氨基酸序列具有2OG-FeⅡ_Oxy加氧酶结构域,LAR氨基酸序列具有GXXGXXG基序和RFLP,ICCN,THD结构域。生物信息学分析结果表明三个基因编码的氨基酸序列均与同科葡萄的F3’,5’H、F3H、LAR氨基酸序列具有较高的同源性,且在系统进化树上汇聚于一支,推测大叶蛇葡萄与葡萄的F3’,5’H、F3H、LAR的催化活性较为相近;(2)为了深入研究黄酮类成分生物合成关键基因的表达量与黄酮类成分含量的相关性,本论文利用高效液相色谱法(HPLC)对大叶蛇葡萄的叶、花和果实进行主要黄酮类成分(二氢杨梅素和杨梅苷)含量测定,同时通过逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)对F3’,5’H、F3H基因表达量进行测定。整合分析F3’,5’H、F3H基因表达量与黄酮类化合物积累量的关联性。实验结果表明,仅有大叶蛇葡萄的F3’,5’H基因与二氢杨梅素和杨梅苷的积累量成正相关(r=0.943、0.957),说明F3’,5’H基因是形成二氢杨梅素和杨梅苷的关键基因,因此对该基因进行了进一步深入研究;(3)采用无缝克隆技术构建了F3’,5’H基因与原核表达载体pET30a的重组质粒,转化BL21(DE3)表达宿主菌进行诱导表达。SDS-PAGE电泳结果表明F3’,5’H融合蛋白的分子量为54.93 KDa,主要以包涵体的形成存在。对包涵体进行纯化复性,体外构建酶促反应体系,验证了F3’,5’H可催化二氢槲皮素转化为二氢杨梅素,说明F3’,5’H所编码的酶具有体外催化活性。