背景与目的:糖尿病肾病(Diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病主要微血管并发症之一,随着2型糖尿病发病率的增加,DKD已成为导致慢性肾脏病和终末期肾病的首位病因,晚期只能依赖肾移植或透析治疗维持肾脏功能,医疗费用巨大,成为全球性公共健康问题。DKD发病机制尚不明确,目前认为是由多种基因与环境因素共同作用所致,主要与遗传因素、表观遗传修饰作用、血流动力学异常、炎症反应、线粒体功能失调等关系密切。越来越多研究证据支持肾脏线粒体功能失调在DKD的发生发展中扮演了关键性角色,肾脏固有细胞在早期糖尿病状态下均存在不同程度的线粒体生物合成、能量代谢和信号传导异常。青蒿素类药物作为抗疟药物的代表,近年研究显示其在炎症性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤和代谢性疾病中也呈现出显著的疗效,而此类药物发挥治疗作用的机制也与调节线粒体功能有关。然而,此类药物在2型DKD领域中的应用尚未见有报道。因此,本课题拟从临床研究部分探讨早中期2型糖尿病肾病患者体质和证型分布规律、代谢特点和肾脏功能形态变化,进而在动物实验研究中验证青蒿素类代表药物蒿甲醚是否可通过改善2型糖尿病小鼠的能量代谢和肾脏功能形态起到肾脏保护作用。方法:1、临床研究选取2016年12月至2018年12月深圳市中医院肾病科招募的临床观察试验志愿者,正常健康对照组(NC组)30例,单纯2型糖尿病组(T2D组)30例,2型糖尿病肾病Ⅰ期和Ⅱ期患者组(DKD(1-2)组)30例,2型糖尿病肾病Ⅲ期和Ⅳ期患者组(DKD(3-4)组)30例。收集各个研究对象的性别、年龄、体重和BMI等基本资料;使用中医综合诊断系统采集中医脉象和舌面象信息,填写中医体质辨识问卷表,然后由系统对各种体质进行自动判别;根据采集到的中医信息并参照中华中医药学会肾病分会制定的标准进行辨证分型;采集血、尿标本;行肾脏超声检查测量双侧肾脏长轴、短轴和厚度,计算肾脏体积;使用全自动生化分析仪检测相关生化指标;使用糖化血红蛋白仪检测糖化血红蛋白;使用代谢组学方法检测血清乙酰基肉碱和丁酰基肉碱含量。2、动物实验研究将8周龄雄性db/db小鼠随机分为2型糖尿病组(即db/db组),db/db+蒿甲醚治疗组(db/db+artemether,即db/db+Art组),野生型对照小鼠作为2型糖尿病正常对照组(T2D control,即T2D-ctrl组)。T2D-ctrl和db/db组小鼠给予标准饲料喂养,db/db+Art组小鼠给予含药饲料(蒿甲醚/饲料:0.67g/kg)喂养,蒿甲醚开始治疗时设置为0周点,共计用药干预12周。使用小鼠代谢笼留取0、6、12周点各组小鼠24h尿液,同时采集24h饮水量、尿量、进食量及粪便量数据;使用能量代谢系统测定0、6、12周点小鼠RER值和能量消耗数据;于0、4、8、12周点称量各组小鼠体重,并使用血糖仪测定空腹血糖。药物干预12周后,留取各组小鼠全血、血清、胰腺、肾脏等标本。使用ELISA试剂盒测定小鼠尿白蛋白排泄率和血清胰岛素;使用生化法测定尿糖结果;在PAS染色下测量肾小球血管襻面积和系膜基质面积,并计算肾小球毛细血管襻体积,测量肾小管面积和肾小管管腔面积,并计算肾小管管壁面积;在HE染色下测量胰腺面积和每个胰岛面积,计算平均胰岛面积、胰岛面积/胰腺面积和胰岛密度;使用激光共聚焦显微镜检测并计算胰岛内α、β和δ细胞阳性面积比例;使用透射电镜测量足细胞足突宽度、肾小球和肾小管基底膜厚度,观察胰岛细胞形态改变;使用UltraRed检测血清H202水平和尿液中H2O2的排泄率;使用免疫组化方法检测肾组织中catalase和SOD2的分布;使用western blot方法检测肾组织中PGC-1α、catalase和SOD2蛋白含量,肾脏线粒体中MPC1、MPC2、PDK1、PDP1、PDH和VDAC蛋白含量。结果:1、临床研究(1)纳入研究的各组病例在性别和年龄方面无显著性差异,具有良好的一致性。而T2D组、DKD(1-2)组和DKD(3-4)组体重及BMI均明显大于NC组,差异有显著性意义。(2)T2D组、DKD(1-2)组和DKD(3-4)组空腹血糖和糖化血红蛋白均明显高于NC组,差异有显著性意义。(3)与NC组比较,DKD(1-2)组和DKD(3-4)组尿ACR均明显高于NC组,差异有显著性意义。与NC组比较,DKD(1-2)组eGFR有显著性升高,DKD(3-4)组eGFR有显著性下降。与T2D组比较,DKD(1-2)组尿ACR并无显著性差别,DKD(3-4)组尿ACR则明显增加,差异有显著性意义。与T2D组比较,DKD(1-2)组eGFR也有显著性升高,DKD(3-4)组eGFR亦有显著性下降。(4)与NC组比较,T2D组、DKD(1-2)组和DKD(3-4)组TG均有明显升高,差异有显著性意义。与NC组比较,T2D组、DKD(1-2)组和DKD(3-4)组HDL均有明显下降,差异有显著性意义。与NC组比较,T2D组、DKD(1-2)组和DKD(3-4)组TC和LDL变化无明显差异。(5)与NC组比较,DKD(1-2)组左肾脏体积和右肾脏体积均明显增大,差异有显著性意义。与T2D组比较,DKD(1-2)组左肾脏体积和右肾脏体积也明显增大,差异有显著性意义。随着疾病发展,DKD(3-4)组肾脏体积有所减小,但与DKD(1-2)组相比,减小并无显著性差异。(6)与NC组比较,T2D组和DKD(3-4)组血清代谢产物乙酰肉碱和丁酰肉碱均有明显增加,差异有显著性意义。与T2D组比较,DKD(3-4)组乙酰肉碱和丁酰肉碱也有明显增加,差异有显著性意义。DKD(1-2)组与NC组和T2D组比较均无明显差异。(7)NC组主要以平和质、气虚质、痰湿质和湿热质为主,有少许气郁质、阳虚质和阴虚质,无血瘀质个体。T2D组无平和质个体,主要以气虚质、痰湿质、湿热质为主,有少许气郁质、阳虚质、阴虚质和血瘀质患者。DKD(1-2)组无平和质个体,主要以气虚质为主,其他类型体质分布相对均匀。DKD(3-4)组无平和质个体,主要以气虚质、阳虚质、阴虚质、血瘀质为主,且无明显规律。(8)T2D组患者主要以阴虚燥热证和气阴两虚证为主,DKD(1-2)期仍以阴虚燥热和气阴两虚证为主,但脾肾气虚证和阴阳两虚证有少许增多,随着疾病进展,阴虚燥热证和气阴两虚证逐渐减少,至DKD(3-4)期转变为以脾肾气虚证为主,阴阳两虚证也有明显增多。2、动物实验研究(1)蒿甲醚可明显降低db/db小鼠尿白蛋白排泄率、减轻肾脏重量、减小肾小球血管襻面积和体积、肾小球系膜区面积、肾小管及其管腔和管壁的面积。(2)蒿甲醚可改善db/db小鼠肾小球和肾小管基底膜厚度、减小足突宽度。(3)蒿甲醚可降低db/db小鼠的空腹血糖和糖化血红蛋白水平、降低尿糖水平、并改善其多饮、多食、多尿、多便的糖尿病症状。(4)蒿甲醚可恢复db/db小鼠胰岛内α、β和δ细胞比例失衡,增加血清胰岛素水平,使胰岛内胰岛素颗粒变得致密浓集,并降低α细胞和δ细胞被观察到的机会。(5)蒿甲醚在不影响单个小鼠总能量消耗的情况下,增加6周点和12周点db/db小鼠的RER值。(6)蒿甲醚可降低db/db小鼠的血清H2O2水平、减少尿液中H2O2的排泄率。(7)蒿甲醚可增加肾组织中PGC-1α水平、线粒体中MPC和PDP1蛋白的含量。结论:(1)随着DKD进展,机体的体质逐渐发生改变,由早期的气虚、痰湿、湿热逐渐发展为阴虚、阳虚和血瘀。机体的证型也由早期阴虚燥热和气阴两虚,逐渐转变为脾肾气虚和阴阳两虚。该过程还伴随着机体能量代谢的转变,即糖利用障碍的同时蛋白质和脂肪酸氧化增强。(2)本研究首次验证了蒿甲醚可显著降低2型糖尿病db/db小鼠的尿白蛋白排泄率,改善肾脏肥大,减轻肾脏病理损伤,起到肾脏保护作用。(3)本研究首次证实了蒿甲醚可在不改变单个小鼠总能量消耗情况下,增加小鼠的RER值,同时蒿甲醚还可增加肾组织PGC-1α水平,调节氧化还原状态,增加肾脏线粒体MPC和PDP1蛋白含量,增强肾脏线粒体对丙酮酸的摄取和氧化能力。