【摘 要】
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Pseudozyma antarctica和Pseudozyma flocculosa都是隶属于担子菌纲的丝状真菌。以它们作为表达系统具有以下优点：1) 丝状真菌的发酵是一门十分成熟的工业技术，有利于重组蛋白生产的工业化；2) 丝状真菌具有很强的分泌能力，有望提高重组蛋白的生产效率；3) 新表达系统的建立可避开许多大肠杆菌重组蛋白生产局限性；4) 糖基化更接近于哺乳动物。在本研究中，首先筛选出可以
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Pseudozyma antarctica和Pseudozyma flocculosa都是隶属于担子菌纲的丝状真菌。以它们作为表达系统具有以下优点：1) 丝状真菌的发酵是一门十分成熟的工业技术，有利于重组蛋白生产的工业化；2) 丝状真菌具有很强的分泌能力，有望提高重组蛋白的生产效率；3) 新表达系统的建立可避开许多大肠杆菌重组蛋白生产局限性；4) 糖基化更接近于哺乳动物。在本研究中，首先筛选出可以在P．antarctica中转录潮霉素抗性基因的hsp70启动子，并利用该启动子和潮霉素抗性基因构建了P．antarctica的双质粒共转化系统。双质粒系统包括：PseⅠ-hyg和Vectour lire。其中PsceⅠ-hyg含有hsp70启动子和终止子以及潮霉素抗性基因，Vectour libre仅含有hsp70启动子和终止子，以便插入要表达的目的基因。 为检验该系统的表达性能，以绿色荧光蛋白为报道基因，设计引物扩增得到该基因后，插入Vectour libre，构建质粒GFP．hsp，将该质粒与PseⅠ-hyg共转化P．Antarctica；同时，设计引物并以GFP．hsp为模板，扩增hsp70启动子、GFP基因和hsp70终止子，将该DNA片段插入质粒PseⅠ-hyg，构建了单质粒转化系统pPgGFP-hyg-0，并实现了上述两个系统在P．Antarctica和P．flocculosa中的绿色荧光表达。 为提高该系统的表达量，我们做了以下两项研究：1．从5’端开始，每100bp缺陷hsp70启动子，减弱启动子的强度，从而提高目的基因在P．antarctica中的拷贝数。实验结果证明，随着启动子长度的减少，转化平板上的转化子数目明显减少；Southern杂交表明，缺陷了100和200个bp启动子的转化子基因拷贝数增加了1／3；Northern杂交表明，缺陷了200bp启动子的转化子潮霉素抗性基因表达减少了一半，而绿色荧光蛋白的表达量是含有完整启动子的转化子的三倍。2．寻找到Usitilago madis的GPD启动子，并对比了它与hsp70对绿色荧光蛋白的表达量。 血小板源生长因子（PDGF）主要存在于血小板中，是一种在凝血过程中释放的生长因子。除了血小板外，PDGF也可由多种类型的细胞产生，它的主要作用是在体外刺激成纤维细胞的再生，也可加速血管平滑肌，骨细胞，软骨细胞，结缔组织细胞，和一些血细胞的有丝分裂。PDGF储存在血小板的α颗粒中并在血小板活化时被释放。PDGF通常是由二硫键相连的二聚体，这些二聚体的亚基是同源的多肽链，被分别命名为PDGF-A和PDGF-B。天然的PDGF可以以同源的二聚体（PDGF-AA和PDGF-BB）或异源的二聚体（PDGF-AB）组成。 设计引物扩增得到PDGF-B基因后，将其插入质粒Vectour libre，得到质粒PDGF．hsp，扩增启动子hsp70、PDGF基因和hsp70终止子，插入PsceⅠ-hyg-3，得
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