中华绒螯蟹DAZAP2通过Hippo信号通路调节抗菌肽表达的机制研究

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我国是水产养殖大国,近年来随着养殖规模的不断扩大,养殖病害日益凸显,如何有效预防病害的发生、提升养殖品种抗病性能,是目前水产养殖业的重要课题。免疫系统是个体抵御外来病原入侵的有效防线,对养殖品种免疫机制的深入研究,不仅有助于我们更好地理解养殖对象的免疫反应机理,也将为细菌性疾病防控提供科学依据。本论文首先基于中华绒螯蟹全基因组测序数据库和大量转录组文库获得了EsDAZAP2的部分开放阅读框(ORF)序列,通过RACE技术扩增得到EsDAZAP2基因cDNA全长。生物信息学分析发现DAZAP2在不同物种间相对保守,且均具有特征功能域和基序。进一步的研究发现EsDAZAP2在中华绒螯蟹不同组织中均有表达,金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌均能诱导EsDAZAP2在血细胞中的显著表达上调,暗示该基因可能与免疫反应有关。为明确EsDAZAP2是否参与中华绒螯蟹固有免疫反应,我们通过RNAi技术敲降了EsDAZAP2基因并细菌刺激,结果发现EsDAZAP2敲降的中华绒螯蟹具有更高的细菌易感性,血淋巴中细菌的cfu也有极显著上升,表明EsDAZAP2在中华绒螯蟹抗菌免疫反应过程中具有重要作用。作为细胞内蛋白,Es DAZAP2具有通过免疫相关信号通路调控抗菌反应的可能。为解决该问题,我们首先考察了EsDAZAP2是否可能调控Toll、IMD、JAK/STAT信号通路,并选取Dorsal、Relish、Stat92E作为上述信号通路的指示蛋白。实验结果表明,金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌均能诱导上述蛋白从细胞质进入细胞核,在干扰EsDAZAP2后,Dorsal的入核受到抑制,而Relish和Stat92E的入核不受影响,暗示Es DAZAP2可能与Toll信号通路有关。为了进一步探究EsDAZAP2与Toll信号通路之间的关系,本研究通过酵母双杂交文库筛选,获得了与EsDAZAP2相互作用的蛋白Es Sav,并通过Co-IP实验验证其蛋白质相互作用。Sav是Hippo通路的关键信号分子,已有研究表明其具有结合并促进Hpo磷酸化的功能,从而激活Hippo信号通路。为明确DAZAP2、Hpo与Sav的结合方式,本研究构建了Sav野生型和功能域缺失型重组质粒,通过转染S2细胞并Co-IP实验证实,EsDAZAP2结合EsSav的WW结构域,而EsHpo结合EsSav的SARAH结构域。为验证Hippo信号通路是否参与中华绒螯蟹抗菌反应,本研究首先用金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌分别刺激中华绒螯蟹,通过Western Blot和免疫荧光实验,检测Hpo的磷酸化以及下游分子Yki的入核情况,结果发现在细菌刺激后,Hpo的磷酸化水平上升,Yki从细胞核内转移到细胞质中,这说明在中华绒螯蟹中细菌刺激能够激活Hippo信号通路。通过RNA干扰实验,发现在干扰Hpo之后,Yki的核转移受到抑制,并在细菌刺激之后,在中华绒螯蟹血细胞中的抗菌肽的转录水平明显下调。通过文献报道,在果蝇中Yki能够调控Toll信号通路的重要组成分子Cactus的表达,我们在中华绒螯蟹的血细胞中干扰EsYki后,发现EsCact的转录水平明显下调。为了进一步验证Hippo通路与Toll通路之间的关系,我们干扰了Hpo检测Dorsal的入核情况,发现Hpo的敲降会抑制Dorsal的入核。这些结果表明Hippo信号通路通过调节Cactus的表达参与了中华绒螯蟹的先天免疫反应。为明确EsDAZAP2与Hippo信号通路之间的关系,我们通过RNA干扰敲降EsDAZAP2,然后用不同细菌刺激中华绒螯蟹的血细胞,检测Hpo的磷酸化水平和Yki的入核情况,实验结果表明干扰EsDAZAP2会降低Hpo的磷酸化水平,以及抑制Yki从细胞核转移到细胞质。这些结果表明EsDAZAP2能够调控Hippo信号通路。综上所述,本研究明确了Hippo信号通路在中华绒螯蟹抗菌免疫反应中的重要作用,并发现DAZAP2通过结合Sav蛋白WW功能域调控Hippo信号通路活化,进而影响抗菌肽表达的功能途径。该研究为无脊椎动物抗菌肽表达调控机制的研究提供了新思路,并为中华绒螯蟹细菌性疾病的防控提供了科学依据。
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