研究目的天然免疫是机体抵御外界病毒感染的第·道防线。机体通过模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR),包括Toll 样受体(Toll-like receptors,TLRs)、RIG-I 样受体(Retinotic acid-induced incduced gene I like receptors,RLRs)、NOD样受体(Nucleotide binding oligomerization domain like receptors NLRs)和多种DNA受体等,识别病原微生物的重要成分即病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP),分别激活各自相应的信号转导通路,最终诱导一系列炎性因子以及干扰因素(Interferons,IFNs)的表达和分泌。其中炎性因子能够进·步激活天然免疫细胞,引发炎症反应,并启动适应性免疫应答;而IFNs在机体中具有抗病毒、抗细菌、抗肿瘤和免疫调节的作用,但是异常的IFNs信号会诱发各种免疫性疾病,因此,精准地调控IFNs对于维持机体免疫稳态具有非常重要的意义。E3 泛素连接酶 RNF128(GRAIL,gene related to anergy in lymphocytes)是一类在适应性免疫中发挥重要调节作用的蛋白。研究发现,RNF128可以通过多种机制诱导CD4+T细胞失能。RNF128通过泛素化作用不仅可以降解TCR-CD3(T细胞活化所需的第一信号),还可以降解CD40L、CD83和CD151(T细胞活化所需的第二信号及共刺激信号),另外,RNF128还可以可以降解T细胞与抗原提呈细胞(antigen-presenting cell.APC)接触时免疫突触形成的重要蛋白(Arp2/3和CoroninlA)。大量的研究也证明,调节T细胞失能的其它几个E3泛素连接酶Cbl-b,c-Cbl和Itch都可以参与天然抗病毒反应。但是RNF128在固有免疫反应中是否发挥作用还未见报道。为了研究RNF128在天然免疫反应中的功能,我们深入探讨了 RNF128对IFNs信号通路的影响,并阐明了相关的分子机制,希望为一些免疫相关性疾病的治疗的研究提供新的参考和方向。研究方法1.分别用poly(I:C)、ISD、SeV或HSV-1转染或感染小鼠原代巨噬细胞和人单核细胞系THP-1细胞,检测不同时间点时RNF128的表达;2.利用RNF128特异性siRNA分别抑制小鼠巨噬细胞和THP-1细胞RNF128表达后,Real time quantitative PCR(qRT-PCR)检测 poly(I:C)、ISD、SeV、HSV-1诱导表达的Ifnb1、Il6、Tnfa、Cxcl10、Mx1及Ccl5表达变化;3.通过qRT-PCR及双荧光素酶报告基因实验寻找RNF128影响IFN-β信号通路的靶基因;通过免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)及免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测 RNF128 与 TBK1 的相互作用;4.通过质粒共转染和和泛素化实验检测RNF128对TBK1泛素化的影响,利用TBK1磷酸化位点突变体探讨RNF128对TBK1泛素化的位点,以及RNF128对感染后细胞的TBK1激酶活性的影响;5.体外水平,空斑试验检测RNF128沉默或过表达后小鼠腹腔巨噬细胞感染RNA病毒或DNA病毒后的抗病毒能力;体内水平,尾静脉注射的方法对Rnf128小鼠分别感染VSV或HSV-1,检测血清及肝、肺或脑中病毒复制情况,并观察对小鼠生存率的影响。结果1.病毒感染后诱导RNF128表达上调为了研究RNF128是否在固有免疫信号通路中发挥作用,我们首先用poly(I:C)和ISD刺激小鼠原代巨噬细胞和人单核细胞THP-1细胞,发现RNF128的mRNA和蛋白水平在刺激后都明显升高。类似的,RNA病毒SeV和DNA病毒HSV-1感染小鼠腹腔原代巨噬细胞和人THP-1细胞也诱导RNF128在mRNA和蛋白水平表达上调。重组IFN-β刺激小鼠腹腔原代巨噬细胞后,RNF128表达水平随着刺激时间的延长而不断升高;封闭了IFN-β受体的实验组在接受病毒诱导后,RNF128的表达升高被抑制了;沉默了小鼠腹腔原代巨噬细胞中STAT1和STAT2的表达,也明显抑制了 SeV-或HSV-1病毒诱导的RNF128表达升高。2.RNF128正调IRF3活性和IFN-β信号通路由于病毒感染引起机体的一个主要效应就是诱导产生IFN-β,我们想进一步探讨RNF128在IFN-β信号号通路中的作用。在小鼠腹腔巨噬细胞和人THP1细胞中的研究结果均显示通过siRNA沉默RNF128后再分别转染Poly(I:C)、ISD或感染SeV、HSV-1,会显著抑制Poly(I:C)、ISD、SeV和HSV-1诱导的Ifnb1及下游相关ISG基因,包括Cxcl10,Mxl和Ccl5表达水平,而不影响Il6和Tnfa的表达。转染Poly(I:C)、ISD或感染SeV、HSV-1后,Rnf128-/-小鼠腹腔原代巨噬细胞中IFN-β的表达与分泌水平与WT组相比明显被抑制,IFN-β下游的Cxcl10,Mx1以及Ccl5基因的mRNA水平也显著低于WT组,而Il6和Tnf表达水平没有显著性差异。在HEK293细胞中我们发现RNF128表达降低能够明显抑制TRIF信号通路以及DNA信号通路和RNA信号通路活化对IFN-β启动子及mRNA的影响。IFN-β的启动子区域有三个转录因子的结合位点,分别是IRF3,NF-κB和AP-1。NF-κB和AP-1分别结合到PRDⅡ和Ⅳ区域,IRF3则结合到PRD Ⅰ-Ⅲ区域。RNF128过表达能够增强TRIF-,MAVS和cGAS+STING诱导的IFN-β活性及PRDⅠ-Ⅲ报告基因活性,而对PRDⅡ和Ⅳ的报告基因活性没有显著影响。说明RNF128通过影响IRF3进而影响IFN-β的表达。转录因子IRF3的磷酸化、二聚化以及入核是IRF3活化过程的三个必要步骤,活化的IRF3才能进一步结合到IFN-β的启动子区域,影响IFN-β的表达。我们分别向HEK293细胞中共转染RNF128过表达载体以及TRIF-,MAVS和cGAS+STING过表达载体,检测IRF3的磷酸化,发现RNF128过表达均能够增强上述信号通路活化引起的IRF3的磷酸化水平。我们进一步以野生型和RNF128缺陷小鼠的腹腔原代巨噬细胞为研究对象,分别用SeV病毒和HSV-1病毒感染细胞,发现RNF128缺陷组腹腔巨噬细胞的二聚化现象较野生组明显减弱。SeV病毒感染野生组腹腔巨噬细胞后,IRF3和P6均明显入核,而RNF128缺陷组IRF3的入核明显受到了抑制,P65入核与对照组相比没有明显变化;同样HSV-1病毒感染后的结果类似。3.RNF128作用靶点为TBK1我们以HEK293细胞为研究对象,共转染了 RNF128过表达质粒以及TRIF-,cGAS+STING-,RIG-IN-,MAVS-,TBK1-以及 IRF3 5D 过表达质粒,RNF128过表达组与对照组相比,TRIF-,cGAS+STING-,RIG-IN-,MAVS-和 TBK1-诱导的IFN-β表达和启动子活性均增强,但是对IRF3 5D诱导的IFN-β表达及报告基因活性没有影响;随后,我们又通过RNF128特异性小干扰RNA沉默HEK293 细胞中的 RNF128 表达,同样转入 TRIF-,cGAS+STING-,RIG-IN-,MAVS-,TBK1-以及IRF3 5D过表达质粒,RNF128沉默降低了 TRIF-,cGAS+STING-,RIG-IN-,MAVS-和TBK1-诱导的IFN-β表达及启动子活性,但是对IRF35D诱导的IFN-β表达和启动子活性没有影响。免疫共沉淀实验(Co-IP)结果显示,RNF128只能够与TBK1发生相互作用,而与其他接头分子没有相互作用。我们又通过免疫荧光实验进行了进一步验证。结果显示二者间存在微弱的共定位,当激活细胞病毒感染信号通路后,共定位现象明显增强。免疫荧光的结果与Co-IP结果一致。4.RNF128促进TBK1发生K63泛素化向HKE293细胞中共转染Myc-TBK1、V5-RNF128野生型和突变载体以及泛素化(Ub)表达载体,Co-IP结果显示RNF128过表达确实能够增强TBK1的泛素化。体外的泛素化系统同样检测到TBK1的泛素化现象。向HEK293细胞中转入了RNF128和TBK1的过表达质粒以及野生型(HA-Ub)和突变型的泛素化质粒,HA-ubiquitin-K48 和 HA-ubiquitin-K63,结果显示 RNF128 过表达诱导 TBK1的泛素化主要是K63位泛素化,而对TBK1 K48位泛素化没有影响。而TBK1 K30或K401位突变后,泛素化作用明显减弱,当这两个位点同时突变后,泛素化作用减弱更加明显。5.RNF128促进TBK1激酶活性为了研究RNF128介导的TBK1泛素化是否影响TBK1的活性,我们分别检测了WT和Rnf128小鼠的腹腔巨噬细胞感染SeV病毒和HSV-1病毒后,TBK1激酶活性,发现Rnf128组的巨噬细胞感染病毒后TBK1激酶活性也明显低于WT组。在HEK293细胞中过表达RNF128后再感染SeV病毒与对照组相比则显著增强TBK1激酶活性;而通过siRNA沉默RNF128后再感染SeV病毒与对照组相比则显著抑制TBK1激酶活性。我们又以Tb1k-/-MEFs细胞为研究对象,通过电转分别转入 Myc-TBK1-WT、Myc-TBK1-K30R、Myc-TBK1-K401R 和Myc-TBK1-K30R-K401R表达质粒。Myc-TBK1-WT转入组检测到显著的TBK1激酶活性以及TBK1磷酸化和Ifnb1表达,而转入RNF128过表达载体能够进一步增强TBK1磷酸化和Ifnb1表达,而TBK1-K30R、TBK1-K401R和TBK1-K30R-K401R转入组过表达RNF128并不能增强TBK1磷酸化和Ifnb1表达。6.RNF128调节TBK1活性具有普遍性已有文献报道MIB1、MIB2和Nrdp1能够促进TBK1发生K63泛素化。为了研究MIB1、MIB2和Nrdp1的泛素化功能与RNF128对TBK1活性调控的关系,我们分别设计了MIB1、MIB2和Nrdp1的siRNA,并转入Rnf128-/-的小鼠腹腔巨噬细胞中。LPS诱导后,siRNA沉默MIB1/MIB2组与对照组相比能够显著抑制SeV-诱导的Ifnb1表达以及IRF3和TBK1磷酸化,而LPS-或HSV-1-感染后则没有这种差异;siRNA沉默Nrdp1组与对照组相比能够显著抑制Infb1表达以及IRF3和TBK1磷酸化,而SeV-或HSV-1-感染后则没有这种差异。7.RNF128能够增强机体抗病毒能力IFN-β的主要功能就是抗病毒感染,下而我们想继续探讨RNF128对抗病毒功能的影响。我们以野生型和RNF128缺陷小鼠的腹腔原代巨噬细胞为研究对象,分别感染了VSV和HSV-1病毒,通过空斑实验检测病毒滴度,结果显示RNF128缺陷组不论被RNA病毒还是DNA病毒感染后,病毒滴度都比野生组显著升高。体外试验证明,RNF128可以增强细胞的抗病毒能力,我们取野生型和RNF128缺陷小鼠各3只,尾静脉注射VSV或HSV-1后检测血清中IFN-β的水平,发现不论是RNF病毒还是DNA病毒感染后,缺陷组血清中IFN-β水平都显著低于野生组;3天后,将小鼠处死,对VSV感染组,分别检测小鼠肝和肺中VSV病毒的滴度和复制,发现Rnf128-/-组显著高于WT组;对于HSV-1感染组,检测脑组织中HSV-1病毒的滴度和复制,同VSV组一样,缺陷组病毒滴度和复制水平较野生组组显著升高。致死实验发现RNF128缺陷组小鼠,不管对VSV还是HSV-1,都更易被感染,生存率降低。结论1.细胞感染RNA或DNA病毒后可以诱导RNF128表达升高。2.RNF128正调控IRF3活性进而正向调控IFN-β信号通路。3.RNF128作用靶点为TBK1。4.RNF128能够促进TBK1发生K63泛素化5.RNF128能够增强TBK1激酶活性6.RNF128对TBK1的活性调控具有普遍性7.RNF128能够促进细胞或机体的抗病毒能力创新性和研究意义1.本研究首次发现E3泛素连接酶RNF128除了具有调控适应性免疫反应的功能外,在天然抗病毒免疫反应中也发挥重要作用,丰富我们对RNF128在免疫反应中功能的认识。2.本研究中,我们阐明了 RNF128正向调控IFN-β信号通路的分子机制。我们首次明确TBK1作为其作用的靶点,可以被RNF128识别并发生K63泛素化,进而增强其激酶活性。3.我们发现RNF128对TBK1的泛素化既可以发生在RNA信号同路中又可以发生在DNA信号通路中。因此RNF128对TBK1的调控作用更具有普遍性。