大黄鱼(Pseudosciana crocea(Richardson,1846))作为我国四大重要海洋经济养殖鱼类之一,正面临着巨大的病害困恼,使得其养殖效益受到前所未有的挑战。属于低等脊椎动物的大黄鱼,其获得性免疫系统相对于高等哺乳动物而言还处于进化上的不完善状态:而其天然免疫系统相对发达,能够有效的防御病原的入侵。为此,我们分析Hepcidin基因,其是一种天然短肽分子,为天然免疫中重要的非特异性免疫分子。本文着重研究大黄鱼Hepcidin基因的多样性、启动子特征以及抗菌分析,为大黄鱼病害防治提供理论和技术支持。　　 通过对大黄鱼poly(I:C)诱导的脾脏组织cDNA文库测序发现多条Hepcidins基因的cDNAs序列。为了进一步分析不同类型的Hepcidin基因在鱼的各个组织如脾脏、肾脏、肝脏、血、肌肉以及肠中表达水平差异,依据Hepcidin一致序列设计引物,对每一个组织进行PCR扩增并将扩增产物(Hepcidin基因库)克隆到T载体；挑取所有的阳性克隆测序并发现Hepcidin基因存在更多的类型。序列比对发现所有的Hepcidin基因可以分为7类,分别为C1-C7(cDNA序列)/PR1-PR7(氨基酸序列)。C6较其它类型Hepcidin序列差最大,存在与铁离子结合相关序列；剩下几类序列相似性较高。各种类型的Hepcidin基因在组织中mRNA的表达水平定义为单一类型的Hepcidin克隆数占总的Hepcidin基因克隆数的比值(％)(第六类除外)；发现C1和C4类Hepcidin基因的mRNA在各种组织中组成型的高水平表达,C7组成型的低水平表达,其它类型Hepcidin基因的mRNA则特异性的低水平的表达于几个组织中。软件分析氨基酸序列包含有三个结构域:分别为信号肽(Signal peptide)(Residues1-25),前导肽(Prodomain),(Residues26-59)以及成熟肽(Mature peptide)(Residues60-85)。为了了解Hepcidin基因组DNA序列的多样性,依据Hepcidin cDNA的共有序列设计引物,PCR扩增出其基因组DNA序列并挑取12个阳性克隆进行测序；结果表明这12个克隆子序列可以归为6类Hepcidin基因组DNA序列,分别称为G1-G6。根据DNA序列一致性比对发现,G1-G6分别与cDNA的C1-C6存在一一对应关系；第7类_Hepcidin cDNA对应的基因组DNA序列未克隆到。6个Hepcidins基因结构都是由3个外显子和2个内含子构成且存在三个突变热点区域分别是第一个内含子、第二个内含子以及第三个外显子；Hepcidin的第一个内含子和第二个内含子都存在规律性的小片段碱基缺失。以上研究表明Hepcidin基因的cDNA可能由多个基因编码。　　 为了进一步探讨以上各类Hepcidins调控区是否存在序列和调控的多样性,通过genome walker技术克隆到6个与Hepcidin基因的各类cDNA相对应的5端调控序列；这6个5端调控序列差异较大,并分别命名为Pro1、Pro2、Pro3、Pro4、Pro5和Pro6。报告基因分析显示Pro1、Pro2、Pro3、Pro4、Pro5和Pro6(删除突变子PF2)都具有强弱不同的启动子活性。　　 通过逐一删除突变和报告基因分析,我们探讨各类Hepcidin5-调控区的基础转录活性位点以及其启动子特征。研究发现:　　 位于ATG上游181nt的STAT转录因子结合序列决定Pro1的基础转录活性。从整体删除突变酶活变化分析:存在一个弱的V型走势并在删除突变子PF4处达到V型的底部,说明在PF4处存在负向调控序列；在删除突变子PF3和PF2存在一个活性突降,推测可能存在类似增强子的元件；以上分析也表明Pro1控制的基因C1存在着复杂的调控机制。　　 Pro2启动子的基础性转录活性是由位于翻译起始位点(ATG)上游195 nt的NFkB转录因子结合位点决定。从整体删除突变酶活变化分析:位于删除突变子PF2与全长野生型之间以及删除突变子PF3/4-2和PF3/4-3之间存在两个显著的突降,由此认为在这几个删除突变子之间的序列存在类似增强子功能的元件；这说明Pro2的调控机制以及由其所控制的基因C2表达调控是非常复杂的。　　 Pro3基础转录活性是由位于翻译起始位点(ATG)上游175 nt的STAT转录因子结合序列决定。从整体删除突变酶活变化分析:发现位于删除突变子PF2和PF5附近存在负向调控序列,而距其较远处存在抑制这种负向调控的结合位点；这说明Pro3的调控机制以及由Pro3控制的基因C3调控机制是很复杂的。　　 Pro4的基础转录活性由位于翻译起始位点(ATG)的上游163 nt的E-box决定。另外,Pro4的删除突变分析呈现出一个V型走势,即从野生型到删除突变子PF4其启动子活性由高到低逐渐降低；但进一步删除后,其活性反而增强,表明在突变子PF4的前后序列中存在着负向调控因子结合位点。结合C4基因的组织表达模式,表明Pro4的启动子及其控制的C4基因受到复杂的调控。　　 Pro5基础转录活性由位于翻译起始位点(ATG)上游440 nt HFH1转录因子结合序列决定。调控模式相对简单且其对应的基因C5低水平特异的表达于几个组织中。Pro6的基础转录活性位点是位于翻译起始位点(ATG)上游到删除突变子PF3之间的序列。尽管由其控制的基因C6在各个组织中都有不同程度的表达且肝中表达水平最高,整个5端调控区却没有活性；总之,Hepcidin各类基因的5端调控区都存在复杂的调控机制,特别是基因C1-C4,暗示其生理功能的重要性。　　 不同浓度的LPS和poly(I:C)对Hepcidin5端调控区启动子活性诱导分析,结果显示:Pro-4在LPS的浓度为6μg/ml时,其启动子活性为未刺激的5倍；Pro3在LPS的浓度为2μg/ml其活性为未刺激的2.5倍；Pro2对LPS刺激响应最大浓度为8μg/ml,其活性为对照的2.5倍；而LPS不能诱导Prol、Pro5和Pro6的启动子活性上调。不同浓度的poly(I:C)刺激,hepcidin启动子活性除了Pro4出现显著上调外(浓度为50μg/ml增加1.5倍),其它几个启动子活性均未出现显著的上调。　　 通过对人工合成Hepcidin成熟肽最低抑制浓度(MIC)的分析发现,不同Hepcidin基因的成熟肽其抗菌谱存在显著差异；然而这些Hepcidin成熟肽都存在8个保守的半胱酸残基,表明其它氨基酸的突变也可以改变其抗菌活性。　　 此外,我们也克隆了TLR22和管家基因β-actin。TLR22是天然免疫受体分子,能够感受病原入侵,并诱导相关抗病基因的表达；β—actin可以作为稳定的内参或其高效的启动子用作转基因大黄鱼的构件。