有害昆虫不仅损害农业生产还会传播多种疾病。杀虫剂是防控害虫的主要手段,但其对人类健康和生态安全的危害以及长期使用导致的害虫抗药性问题都不容忽视。杀虫剂新靶标及化学实体的持续创新是应对这些问题的重要途径。几丁质是构成昆虫表皮、气管及中肠围食膜的主要结构组分,但在高等动植物体内没有分布。几丁质合成或降解异常均会导致昆虫死亡。因此,参与几丁质合成和降解过程的关键蛋白质是潜在的绿色农药靶标。昆虫β-N-乙酰己糖胺酶（Hex1）是其蜕皮液中唯一可以将几丁寡糖水解至单糖的几丁质水解酶。如果发现可以特异性抑制昆虫Hex1活性的天然产物,就可能通过扰乱昆虫特有的蜕皮过程来实现对害虫的绿色防治。几丁质合酶是几丁质生物合成过程中的关键酶。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的研究表明,除几丁质合酶外,几丁质合成还需要一些几丁质合酶互作蛋白的辅助。目前对昆虫几丁质合成机理及其中涉及的蛋白质还知之甚少。因此,对昆虫几丁质合酶互作蛋白的研究不仅有助于了解昆虫几丁质合成机理,还可以为害虫防治提供新的分子靶标。本课题组前期已经对参与昆虫表皮降解的几丁质水解酶进行了深入研究,不仅建立了成熟的几丁质水解酶抑制剂筛选评价体系,还解析了包括农业害虫亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）β-N-乙酰己糖胺酶OfHex1在内的多个几丁质水解酶的晶体结构,为针对几丁质降解的抑制剂理性设计和改进提供了扎实的理论支撑。因此,基于成熟的评价体系和对靶标的深入了解,本论文首先针对OfHex1进行了抑制剂的筛选及抑制机理研究。在完善了对昆虫几丁质降解的认知后,几丁质合成系统成为新的研究重点。目前对昆虫几丁质合成系统的研究较少,除几丁质合酶外,还不清楚哪些蛋白可能成为潜在的杀虫剂靶标。因此,在模式生物黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中鉴定几丁质合酶1（Krotzkopf verkehrt,Kkv）的相互作用蛋白,并通过RNAi研究其生理功能。最终取得以下成果:（1）小檗碱是OfHex1的高效抑制剂通过抑制常数测定,证明小檗碱是OfHex1的竞争性抑制剂,Ki值为12μM。此外,小檗碱及其类似物（芬氏唐松草定碱和黄藤素）对其他糖基水解酶的抑制活性均弱于OfHex1,存在不同程度的选择性。复合物晶体和分子对接表明,小檗碱通过一种不同于过渡态类似物或底物类似物的非经典模式与目标酶结合。带正电荷的共轭平面是小檗碱的核心药效团,不仅与活性口袋中保守的色氨酸残基形成π-π堆积作用,还与周围带负电荷的谷氨酸或天冬氨酸残基形成静电相互作用。（2）类胆碱转运体蛋白2（Choline transporter-like protein 2,Ctl2）、CG8654和钾-氯协同转运蛋白（Kazachoc,Kcc）是Kkv的互作蛋白通过三种独立的结合实验:免疫共沉淀（co-IP）、针对膜蛋白改进过的酵母双杂交（MYTH）和Pull-down实验,在黑腹果蝇中鉴定到Ctl2、CG8654和Kcc可以与Kkv直接相互作用。截短体分析表明,Ctl2、CG8654和Kcc中的多个截短体共同参与了相互作用。Kkv-NTR的截短体TM1对于Kkv与Ctl2间的相互作用是必不可少的,而截短体TM2、TM6、TM7和TM8负责与CG8654和Kcc相互作用。（3）Ctl2、CG8654和Kcc在几丁质生物合成中发挥重要作用通过黑腹果蝇的Gal4/UAS系统,分别在果蝇全身以及含有几丁质的表皮和气管组织中实现针对Ctl2、CG8654和kcc的组织特异性RNAi。实验组果蝇在一龄幼虫期或蛹期死亡,证明Ctl2、CG8654和Kcc在果蝇中具有重要生理功能。结合温控因子Gal80ts,使用nub-Gal4从二龄幼虫期开始降低翅成虫盘中Ctl2基因的表达,最终导致成虫翅萎缩、肿胀和积液,翅膜表面通透性增强,翅脉几丁质含量降低,翅脉表皮变薄及原表皮几丁质层状结构消失等。在ap-Gal4的驱动下,在翅的背侧干扰CG8654和kcc的表达,导致所有的果蝇翅畸形并在中部出现鼓泡,翅第一纵脉背侧的几丁质含量也有不同程度的降低;同时,干扰CG8654的果蝇中,翅背侧前表皮的几丁质层状结构丢失。这些结果表明Ctl2、CG8654和Kcc参与了翅的几丁质生物合成,是潜在的绿色农药靶标。综上,本研究发现了针对几丁质降解关键酶β-N-乙酰己糖胺酶的新型高效抑制剂,并揭示了其抑制机制,为开发针对几丁质代谢酶的绿色杀虫剂提供了骨架结构。研究还发现几丁质合酶互作蛋白Ctl2、CG8654和Kcc在几丁质生物合成中发挥重要作用,可能为害虫防治提供新的有前景的靶标。