随着工农业生产的快速发展和人口的急剧增长，水体富营养化的问题日益加剧，已经成为一个世界性的问题，严重危害供水及生态环境和可持续发展，如何有效的治理和保护人们赖以生存的水资源，具有重要的社会和经济意义。在我国131个主要湖泊中，已达富营养程度的占51.2％。一般来说。水体中总磷和无机氮分别为0.020mg/L和0.300 mg/L就可以认为水体已处于富营养化的状态。但是，单方面的磷或氮的负荷偏高都不会导致水体的富营养化，而是它们共同作用的结果。在一般情况下，水体中藻类可利用的氮远比可利用的磷多，因此，减少外源性磷进入水体的数量是有效控制富营养化的有力手段。 许多微生物都具有过量积累磷的能力。废水的生物除磷(BPR)主要是通过聚磷菌(PAOs)在厌氧条件下释磷和好氧时对磷的过量吸收实现的。利用微生物这个特性进行生物除磷具有运行成本低，二次污染少的优点。但是大部分菌株如大肠杆菌的过量积累磷的能力很低，或者需要厌氧和好氧交替的环境条件才能有效积磷，因此采用基因工程技术提高微生物积累磷的效率，使得菌株能够有效的去除水体中的磷具有十分重要的意义。 无机多聚磷酸盐(聚磷)是由3到1000多个不等的正磷酸盐基团由高能磷酸键连接而成的线性多聚体。它广泛存在于各种生物体中，包括微生物，原生动物，植物和哺乳动物。由于物种，生长条件和生理条件的不同，聚磷的长度由3到1000个磷酸基团不等。在大肠杆菌中，聚磷的长度普遍为750个磷酸基团左右。聚磷是由磷酸激酶(PPK)催化合成的，它可逆地将高能载体ATP上的γ磷酸盐转化成为聚磷。并且，编码PPK的基因已经被克隆和过量表达。大肠杆菌的ppk基因包含由2064bp组成的开放式阅读框(nt187-2250)来转录PPK酶。 本研究利用大肠杆菌的已知序列来设计引物，利用PCR技术扩增出大小约为2000bp的基因片断，经过测序表明，该片段含大肠杆菌ppk基因完整的阅读框(2066bp)，序列与已报道的大肠杆菌ppk基因(Gebank登录号：L03719)的序列一致。然后利用限制性内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ分别酶切目的基因片段和空表达载体pET-28a(+)，我们将ppk基因定向重组入表达载体pET-28a(+)中，然后转化表达菌株BL21(DE3)，从而构建出聚磷菌，定名为BL—PPK。 对聚磷菌BL-PPK进行了RT-PCR和酶活的测定。RT-PCR的实验结果显示，在加入IPTG诱导后，聚磷菌BL-PPK中mRNA的量明显高于对照菌株BL21，这表明BL-PPK基因工程菌中ppk基因在IPTG的诱导下获得了有效的表达。分别对对照菌株BL21和基因工程菌BI-PPK体内的聚磷含量进行测定的结果显示，对照菌BL21在IPTG诱导后0-10h间细胞内聚磷含量一直处于较低的水平，且略有下降。而基因工程菌BL-PPK内的聚磷含量在IPTG的诱导后则显著增加，从开始时的0.535 mg/g到1h时达最高值3.353mg/g，为开始时的6倍多。诱导后10 h，BL-PPK的聚磷含量达到了约为对照菌的20倍。对对照菌株BL21和基因工程菌BL-PPK培养液中可溶性磷酸盐含量的测定也显示，对照菌BL21在IPTG处理后培养液中磷酸盐浓度变化不大，一直维持在较高的水平。而BL-PPK菌培养液中磷酸盐浓度则显著下降。在IPTG诱导后10 h，BL-PPK培养液中磷酸盐浓度下降到约为对照菌培养液中的磷酸盐浓度的1/9。同时，对于两菌株生长曲线的测定还发现，聚磷对于基因工程菌的生长没有造成负担，相反在稳定期，对于菌株的生长具有促进作用。 实验结果表明，转ppk基因菌株BL-PPK通过大量合成聚磷激酶(PPK)，能够大量合成聚磷，并储存于菌体之内，从而有效地去除了水体中的可溶性磷。实验证明了构建过量表达ppk基因的工程菌的可行性。因此，我们获得的可以有效地去除水体中磷的BL-PPK转基因菌将有可能应用于废水的生物除磷。利用这种方法不但可以大大提高磷的去除效率，而且，由于在传统的除磷工艺中，只有在好氧/厌氧交替的条件下，聚磷菌才能有效地去除水体中的磷，而基因工程菌BL-PPK不需要经过厌氧过程，就能够大量合成聚磷。因此，与传统的除磷方法相比，它在处理工艺上将可以省去厌氧过程，这将大大降低处理成本和控制难度。同时，它对于将聚磷基因转入到水生植物中，构建超聚磷水生植物以去除富营养化湖泊底泥中过量的磷的研究打下了良好的基础。