活性氧(ROS)是植物在进行有氧代谢过程中不可避免的副产物。当植物遭遇逆境胁迫时,活性氧会在体内大量积累,并对蛋白质、DNA、脂质造成氧化伤害,引起细胞损伤,所以长期以来活性氧被认为是一类毒害分子。然而,随着近年来的研究发现,活性氧尤其是其中的过氧化氢(Hydrogen peroxide,H2O2)还可作为信号分子调控植物的生长发育和逆境响应,但是其中的信号转导途径以及过氧化氢如何与其它激素信号和环境信号交叉互作来调控植物生长发育和逆境响应的分子机理并不清楚。油菜素内酯(Brassinosteroid,BR)是一种重要的植物激素,调控植物生长发育的多个方面。本研究采用生物化学、分子生物学、基因组学、遗传学及细胞生物学等手段,对H202与BR交叉调控植物生长发育的分子机制进行探究。我们取得的主要研究结果如下:1.BR诱导植物体内H2O2的积累。外源BR处理后,在野生型Col-0以及BR缺失突变体rot3-2中会积累H2O2,但在BR不敏感突变体bri1-116中H2O2的含量没有改变。此外,NADPH氧化酶抑制剂Diphenylene iodonium(DPI)与BR同时处理时,BR不能诱导植物中H2O2的积累,说明BR通过BRI1介导的信号转导途径诱导H202的产生,并且这个过程依赖于NADPH氧化酶的活性。2.BR促进细胞的伸长需要H2O2。为了探究H202在BR介导的植物生长发育过程中的作用,我们利用H2O2合成抑制剂DPI以及H2O2含量较低的遗传材料CAT2-Ox,rbohD rbohF研究H2O2对BR信号转导的影响。实验结果显示,DPI处理导致植物对BR促进细胞伸长的响应降低,并且随着DPI浓度的升高,最终会导致植物对BR不敏感。为了验证DPI的抑制效果是由于H2O2含量降低引起的,我们在DPI处理时加入H2O2再分析植物对BR的敏感性。实验结果显示,H2O2可显著提高DPI引起的植物对BR不敏感。为了进一步验证以上结果,我们利用H2O2含量降低的遗传材料CAT2-Ox和rbohDrbohF分析植株对BR的响应。结果显示这些H2O2含量降低的遗传材料在下胚轴伸长实验中都表现为BR弱敏感。这些结果说明,H202缺失抑制植物对BR的响应,而BR促进植物细胞伸长需要H202。3.H202促进BR诱导的细胞伸长不依赖BIN2。BIN2是BR信号通路中的负调控因子,依赖其激酶活性,BIN2可以磷酸化不同的底物参与多种信号途径。最新的研究表明,BR信号转导途径中的负调控因子BIN2的激酶活性能被一氧化氮(Nitric oxide,NO)抑制。而且,NO和H202有时会作用于同一目的蛋白来调控植物的生长发育和逆境响应。为了验证H202是否通过调节BIN2的活性参与BR信号转导途径,我们利用GSK3蛋白家族的抑制剂Bikinin、氯化锂以及BIN2和其同源基因BIL1/2的缺失突变体bin2b1l bil2分析H202对下胚轴伸长的影响是否跟BIN2相关。结果显示,即使在BIN2以及其同源基因功能缺失的情况下,当H202水平降低的时候BR诱导的机体响应依然会受到抑制。此外,我们利用BZR1缺失与BIN2相互作用区域的转基因材料BZR1 △DM-Ox、BZR1功能获得突变体bzr1-1D和BZR1同源基因BES1功能获得突变体bes1-D分析缺失H202后的下胚轴表型。实验结果显示,在H202缺失的条件下,它们的下胚轴伸长被显著抑制。我们还分析了H202和BZR1在根中的分布模式,发现H202和有活性的BZR1具有类似的分布模式,这一结果说明二者存在相互作用的共定位基础。所以我们得出结论H202在BR信号转导过程中的作用位点位于BIN2的下游,可能通过BZR1来调控植物生长发育。4.H202促进BZR1的转录调控活性。为进一步研究H202通过BZR1来调控植物的生长发育,我们比较分析了野生型Col-0和BZR1功能获得型突变体bzr1-1D在正常条件、DPI介导的H202缺失条件及DPI+H202条件下的转录组差异。实验结果显示在正常条件下有4428个基因受BZR1调控,但其中64%的基因在H202缺失的条件下不再受BZR1调节,然而在H202重新处理后又有48%的基因开始响应BZR1的调控。进一步利用散点图进行分析,结果显示DPI会抑制BZR1的转录活性,其调控能力为正常条件下的67%,而在重新施加H2O2后BZR1的转录活性恢复到正常条件下的87%。此外,我们发现,在4428个受BZR1调控的基因中,有2200个同时受DPI调节,其中有2053个基因(93.3%)以相反的表达模式受bzr1-1D和DPI的调控。这些结果表明H2O2促进BZR1的转录活性。5.H202不改变BR诱导的BZR1的蛋白稳定性、磷酸化水平和亚细胞定位。BZR1作为BR信号途径中的关键转录因子,目前报道的BZR1调控方式主要包括磷酸化-去磷酸化修饰、蛋白稳定性调控和细胞质-细胞核定位调控。为了分析H2O2是如何促进BZR1转录活性的,我们分别在正常条件下,DPI介导的H202缺失条件下和H2O2处理条件下,分析BZR1的蛋白含量和磷酸化水平。实验结果显示,DPI和H2O2处理都不会影响BZR1的蛋白稳定性和磷酸化水平。我们进一步利用激光共聚焦显微镜观察不同处理条件下BZR1的亚细胞定位情况,结果显示,不管是在DPI存在条件下,还是在外源施加H202的情况下BR诱导的BZR1进核现象都没有改变。这些结果说明H202调控BZR1的转录活性与BZR1的蛋白稳定性、磷酸化水平和亚细胞定位无关。6.H2O2不影响BZR1的DNA结合能力。BZR1作为转录因子,DNA结合能力会影响其转录活性,因此我们利用染色质免疫共沉淀(ChIP)和DNA-protein pull-down两种方法分析BZR1与其靶基因启动子pDWF4和pSAUR15的结合能力是否受H202影响,这两种方法的分析结果显示,H202并不影响BZR1与pDWF4和pSAUR15结合能力。7.H202氧化修饰BZR1。H202作为一种信号分子可以通过对目的蛋白的氧化修饰来调节其活性。所以我们推测H202可能通过对BZR1进行修饰来调控植物细胞伸长。为了验证这一假设,我们利用BIAM-labeling assay和Biotin-switch assay分析BZR1的氧化修饰状态。实验结果显示,H2O2促进BZR1发生氧化修饰,并且这种氧化修饰主要发生在第63位的半胱氨酸。液相色谱-串联质谱(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC/MS)的结果进一步证明 H2O2 氧化修饰BZR1。我们发现外源BR的处理不仅能诱导植物体内的BZR1发生去磷酸化,还会诱导BZR1发生氧化修饰。此外,我们发现H202还诱导BZR1的同源基因BES1发生氧化修饰,并且修饰位点发生在与BZR1中Cys-63对应的第84位的保守半胱氨酸。这些结果说明H202诱导BZR1/BES1在保守的半胱氨酸位点发生氧化修饰。8.Cys-63是BZR1发挥功能的关键位点。生物化学以及质谱分析的数据都显示Cys-63是H202修饰BZR1的重要位点,那么半胱氨酸在BZR1行使功能的过程中起什么作用呢?为了探求这个问题,我们构建了以bzr1-1D为背景的半胱氨酸突变体转基因材料包括:bzr1-1D-Ox,bzr1-1DC63S-Ox,bzr1-1DC63,73S-Ox,bzr1-1DC91,174,240S-Ox和bzr1-1D5S-Ox。PPZ敏感性分析实验结果显示,bzr1-1D-Ox,bzr1-1DC91,174,240S-Ox呈现出PPZ不敏感的表型。相反bzr1-1DC63S-Ox,bzr1-1DC63,73S-Ox以及bzr1-1D5S-Ox对PPZ的不敏感表型被明显抑制。长日照生长3周的幼苗,对其叶片表型分析结果显示,bzr1-1D-Ox,bzr1-1DC91,174,240S-Ox呈现出叶片卷曲的表型,而这种表型在bzr1-1DC63S-Ox,bzr1-1DC63,73S-Ox以及bzr1-1D5S-Ox中被显著抑制。qRT-PCR和原生质体瞬时表达分析的结果显示,bzr1-1DC63S和bzr1-1D5S对下游基因的转录调节能力明显低于bzr1-1D。综合以上结果,我们发现只要是包含Cys-63位点突变就会影响BZR1的功能,说明Cys-63在BZR1行使功能的过程中起至关重要的作用。对BZR1同源基因BES1的研究得到类似的实验结果,Cys-84突变会显著降低BES1的功能。这些结果说明进化上保守的Cys-63对维持BZR1的功能起重要的作用。9.H202促进BZR1与PIF4、ARF6的相互作用。对基因组学数据分析,结果显示H202依赖的BZR1调节基因多富集在PIF4诱导的以及IAA3抑制的基因中。而且原生质体瞬时转化实验的结果也显示,共转PIF4或者ARF6时,可以增强BZR1转录活性。因此我们推测,H202通过促进BZR1与PIF4或者ARF6的相互作用,进而增强BZR1的转录活性。为了验证这一假设,我们运用GST pull-down,rBiFC以及免疫共沉淀(Co-IP)的方法分析BZR1与PIF4或者ARF6的相互作用强度是否会被H2O2加强。结果显示,H202可以显著增加BZR1与PIF4或ARF6的相互作用,相反,突变BZR1蛋白中可以感知H2O2的半胱氨酸位点后,BZR1与二者相互作用强度被减弱。因此,我们可以得出结论,H202氧化BZR1可以促进其与PIF4或ARF6的相互作用,进而增强BZR1的转录活性。综上所述,BR调控植物细胞伸长需要H2O2,H202缺失会导致植物对BR不敏感。H202能氧化修饰BR信号转导途径中的关键转录因子BZR1,促进BZR1与其互做蛋白PIF4或者ARF6的结合能力,增强了BZR1的转录调节能力,进而调控基因表达,促进植物细胞伸长。本研究为进一步探索H202作为信号分子调控植物生长发育和逆境响应提供了新的证据。同时,H2O2通过氧化修饰BZR1参与BR信号转导过程也极大地丰富和拓展了 BR调控网络,为更好的阐明植物生长发育与环境适应的机制提供了新的依据。