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[研究背景]慢性肾脏疾病(Chronic kidney disease,CKD)已经成为一个全球性的健康问题。近年研究表明,肾小管间质病变程度对肾功能的影响较肾小球病变更大。肾小管上皮细胞(Human kidney-2 cells,HK-2cells)在肾毒性物质刺激下可出现代谢活性降低、肥大等病理改变,最终导致肾小管间质纤维化。自噬是普遍存在于真核细胞中的一种溶酶体依赖的胞内降解途经。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是细胞损伤的早期应激事件。本课题组前期研究发现,晚期氧化蛋白产物(advanced oxidation protein products,AOPPs)刺激可诱导HK-2细胞出现ERS,还可抑制HK-2细胞的自噬活性,而其具体机制仍有待阐述。近年相继有研究报道ERS和自噬之间存在直接联系,但是AOPPs诱导的ERS与自噬活性降低之间是否存在联系及其具体关联机制仍不明确。在慢性肾脏病中,通过肾脏修复来延缓进一步的肾损伤具有一定治疗前景。目前,人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)作为研究热点已被运用于修复慢性肾脏病的细胞组织损伤,起到了一定的效果。hUC-MSCs来源的膜微囊可以趋化其他细胞迁徙至损伤部位,并可通过遗传信息的传递,促进细胞增殖分化,从而达到损伤修复的目的。而hUC-MSCs能否增加AOPPs抑制的HK-2细胞自噬活性及其相关机制仍有待阐述。[研究目的]本研究是以体外培养的HK-2细胞为主要研究对象。首先,主要探讨AOPPs诱导的ERS是否参与HK-2细胞的自噬抑制及其机制;并探讨hUC-MSCs能否增加AOPPs抑制的的HK-2细胞的自噬及其机制。[研究方法]1.体外制备去除内毒素AOPPs修饰蛋白及鉴定2.HK-2细胞的培养3.探讨AMPK(腺苷酸活化蛋白激酶,AMP-activated protein kinase)/mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白,mammal target of rapamycin)信号通路是否参与了AOPPs对HK-2细胞自噬活性的抑制:AOPPs刺激HK-2细胞,检测信号通路AMPK/mTOR蛋白的表达。AMPK抑制剂Compoun C和激活剂AICAR分别预处理HK-2细胞,并予AOPPs刺激,检测自噬标志物LC3II/LC3I、Beclin1、p62及AMPK/mTOR蛋白的表达;4.明确ERS是否通过调控AMPK/mTOR信号通路参与了 AOPPs诱导的HK-2细胞自噬水平的抑制:ERS激活剂Thapsigargin与抑制剂Salubrinal分别预处理HK-2细胞,并予AOPPs刺激,检测ERS标志物、自噬标志物LC3II/LC3I、Beclin1、p62 及 AMPK/mTOR 蛋白的表达。5.探讨hUC-MSCs能否增加AOPPs抑制的HK-2细胞的自噬活性及抑制AOPPs诱发的HK-2细胞的ERS:AOPPs刺激后的HK-2细胞与hUC-MSCs共培养,检测自噬标志物蛋白LC3II/LC3I、Beclin1、p62及ERS标志物GRP78、CHOP的mRNA和蛋白水平表达。6.明确hUC-MSCs能否通过抑制ERS介导自噬活性的升高:予AOPPs刺激后加入hUC-MSCs与HK-2细胞共培养,并加入ERS激活剂,检测自噬标志物LC3II/LC3I、Beclin1、p62 及 ERS 标志物 GRP78、CHOP 的 mRNA 和蛋白水平表达。[结果]1.AMPK/mTOR信号通路参与了 AOPPs对HK-2细胞自噬活性的抑制作用免疫印迹的结果显示:AOPPs可抑制AMPK磷酸化和诱导mTOR磷酸化。AMPK抑制剂单独处理HK-2细胞后,表现出与AOPPs相似的效应,即自噬活性受抑制,LC3II/LC3I和Beclin1表达降低,p62表达升高,同时抑制AMPK磷酸化,增加mTOR磷酸化;而AMPK激活剂与AOPPs共同作用于HK-2细胞后,可部分逆转AOPPs的作用,表现为激活AOPPs抑制的AMPK磷酸化及抑制AOPPs诱导的mTOR磷酸化,同时使自噬水平增高。2.ERS可能通过调控AMPK/mTOR信号通路参与了 AOPPs诱导的自噬活性的抑制作用免疫印迹结果显示:加入ERS激活剂后,ERS标志蛋白GRP78表达增加,同时抑制AMPK磷酸化和诱导mTOR磷酸化,并使自噬活性降低,LC3II/LC3I和Beclin1表达降低,p62表达升高,与AOPPs作用相似。而加入ERS抑制剂后,ERS标志蛋白GRP78表达下降,AOPPs抑制AMPK磷酸化和诱导mTOR磷酸化的效应可被部分逆转,同时AOPPs抑制的自噬也被部分逆转。3.hUC-MSCs可增加AOPPs抑制的HK-2细胞的自噬活性及抑制AOPPs诱发的HK-2细胞的ERS免疫印迹显示:AOPPs处理细胞后加入hUC-MSCs与HK-2细胞共培养,LC3II/LC3I和Beclin1表达升高,p62表达降低,即自噬活性升高。同时RT-qPCR和免疫印迹显示:ERS标志物GRP78、CHOP的mRNA和蛋白表达下降,即诱发的ERS现象被部分抑制。4、hUC-MSCs可能通过抑制HK-2细胞的ERS增加自噬RT-qPCR和免疫印迹显示:在hUC-MSCs与HK-2的共培养系统中加入ERS激活剂后,HK-2细胞的自噬活性降低,表现为LC3II/LC3I及Beclin1表达降低,p62表达升高。[结论]ERS可能通过调控AMPK/mTOR信号通路参与AOPPs诱导的HK-2细胞自噬抑制的发生。hUC-MSCs可能通过抑制ERS增加AOPPs抑制的HK-2细胞的自噬活性。