论文部分内容阅读
近年来的研究结果表明,氨基酸不仅是蛋白质合成的底物,而且能够作为生物信号直接参与蛋白质合成的调节。为研究必需氨基酸(EAA)通过细胞内信号途径调控乳蛋白合成的机制,本文以牛乳腺上皮细胞系(MAC-T)为材料,系统研究了10种EAA对调控乳蛋白合成关键信号途径的影响,以泌乳小鼠为模型,以仔鼠体增重衡量蛋白合成速率研究了调控乳蛋白合成潜力EAA对泌乳的影响及机制。单一EAA对调控乳蛋白合成关键信号蛋白磷酸化程度的影响。本试验以MAC-T为试验材料,试验处理为在依次缺失一种EAA的DMEM/F12培养基上培养,以含有全部EAA的DMEM/F12培养基培养为正对照,以缺失全部EAA的DMEM/F12培养基培养为负对照。分别缺失10种EAA对蛋白合成过程中主要信号蛋白磷酸化程度有极显著影响,负对照mTOR磷酸化程度下降58%,缺失Met、Ile或Val使mTOR磷酸化程度分别下降38%、41%、42%;单一EAA缺失降低细胞内4eBP1的磷酸化程度,其中缺失Met、Ile、Thr和Lys分别下降39%、41%、36%和42%;缺失Met、Ile、Leu、Val时S6K1的磷酸化程度分别下降33%、38%、41%、40%;单一EAA缺失显著提高eEF2磷酸化程度,其中缺失Met、Lle、Val磷酸化程度分别提高18%、20%、18%;缺失所有EAA和Met eIF2α磷酸化程度分别提高49%和39%。结果表明,单一EAA主要影响细胞内mTOR和GCN2 2条通路中关键信号蛋白的磷酸化,且关键信号蛋白对完全缺失Met、Leu、Ile、Thr、Val、Lys反应敏感。Met、Leu、Ile、Val对调控乳蛋白合成关键信号蛋白的影响。为研究信号蛋白反应敏感EAA的作用效果,以MAC-T为试验材料,首先研究不同浓度EAA对调控蛋白合成关键信号蛋白的影响以确定细胞内EAA缺乏状态,EAA缺乏时添加Met、Leu、Ile、Val以及这四种EAA两两组合。随着EAA浓度的变化信号蛋白磷酸化程度符合米氏方程变化趋势,EAA浓度20%以下信号蛋白磷酸化程度变化幅度较大,当EAA浓度在30%-90%之间信号蛋白的磷酸化程度变化趋于稳定,据此确定10%为后续研究EAA缺乏状态的浓度。EAA缺乏状态添加Met、Leu、Ile、Val以及这四种EAA两两组合,添加Leu、Ile、Met和Leu、Met和Ile、Leu和Ile mTOR磷酸化程度分别提高47%、69%、187%,200%和165%;单独添加Leu、Ile、Val提高4eBP1的磷酸化程度,且同时添加Met和Leu、Leu和Ile、Val和Ile有加性效果;添加Ile S6K1磷酸化程度提高63%,且Ile与其他三种氨基酸组合有加性作用。结果表明,EAA缺乏时添加Met、Leu、Ile、Val影响提高mTOR通路中信号蛋白的磷酸化程度,且四种氨基酸两两组合对信号蛋白的磷酸化有叠加作用。Leu、Ile、Met、Thr对泌乳小鼠乳蛋白合成的影响。为评估体外试验中乳蛋白合成调控潜力EAA对泌乳的贡献及作用机制,首先确定小鼠蛋白缺乏状态,建立仔鼠体增重和不同蛋白水平的反应曲线,试验选取分娩日期相近的孕鼠,日粮蛋白水平分别为6%、9%、12%、15%、18%、21%、24%,和27%。当蛋白水平低于21%时,随蛋白浓度的增加仔鼠体增重增加,仔鼠体增重随蛋白水平的提高成米氏反应趋势,最大体增重一半时的蛋白水平为14%,最大体增重为113g;随日粮蛋白水平提高泌乳小鼠乳腺组织中S6K1磷酸化程度提高,eEF2的磷酸化程度降低。根据以上结果,确定15%为日粮低蛋白,即负对照,21%为日粮高蛋白,即正对照,低蛋白基础上分别添加Met、Leu、Ile、Thr。低蛋白日粮添加Met、Leu、Ile仔鼠体增重分别提高10%、11%、9%;添加Met、Leu、Ile和Thr后泌乳小鼠乳腺组织中mTOR的磷酸化程度分别提高了55%、34%,、47%和45%;必需氨基酸处理提高泌乳小鼠血浆IGF-1的浓度;仔鼠窝增重和乳腺组织中mTOR,相关系数为0.40。结果表明,低蛋白日粮添加Met、Leu、Ile独立刺激乳蛋白合成速率(仔鼠窝增重),且主要通过mTOR信号通路。Met、Leu诱导内分泌变化对泌乳的影响。初探泌乳潜力EAA(Met、Leu)诱导内分泌的变化对泌乳的影响机制,本试验以泌乳小鼠为模型,以仔鼠体增重衡量蛋白合成速率,低蛋白日粮添加Met、Leu。Met、Leu提高泌乳小鼠仔鼠体增重;添加Met提高泌乳小鼠血浆胰岛素水平,Met、Leu提高血浆中IGF-1水平,提高乳腺组织中Akt的磷酸化程度;Met明显增加泌乳小鼠胰腺中胰岛素分泌和肝脏中IGF-1的分泌,且Met、Leu引起的肝脏差异基因主要富集在胰腺分泌和胰岛素信号途径。综上,在体外,单一EAA主要影响细胞内mTOR和GCN2通路中关键信号蛋白的磷酸化,Met、Leu、Ile、Val对细胞内控制蛋白合成关键信号蛋白的磷酸化有单独和叠加作用;在体内,蛋白缺乏日粮补充Met、Leu、Ile独立刺激乳蛋白合成速率(仔鼠窝增重),可见“木桶理论”不适用于泌乳动物,且Met、Leu、Ile对乳蛋白合成速率的影响主要通过mTOR信号通路,不依赖于GCN2信号通路,Met、Leu诱导激素的变化是EAA调控乳蛋白合成的另一重要途径。