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单克隆抗体（简称单抗）药物是一类大分子糖蛋白药物,在癌症、自身免疫疾病以及病毒感染等多种疾病的治疗中疗效显著,具有广泛的临床应用前景,是目前生物治疗药物的研究热点之一。单抗药物的生物加工过程复杂,涉及药物分子的结构-功能研究、细胞系开发和下游纯化等过程。单抗药物结构以及药物中杂质类型、含量的微小变化都可能对产品安全性和有效性产生显著影响,因此在生物加工的每个过程都需要对单抗药物的质量进行分析与控制。建立高效、灵敏、准确的单抗药物结构表征与杂质分析方法,是单抗药物研发、生产和监管的重要技术支撑。本研究基于质谱技术,建立了全面表征单抗药物结构的整合分析策略,包括完整质量分析、自中而下（Middle-down）、自下而上（Bottom-up）和游离N-聚糖分析。在完整蛋白水平上,通过优化液相分离的流动相、色谱柱和质谱参数,建立了完整质量分析新方法。建立的非变性（Native SEC-MS）和变性（Denatured RPLC-MS）完整质量分析方法能够在5 min内实现单抗药物的准确分子量测定以及N-糖基化修饰分析。将建立的非变性和变性完整质量分析方法用于曲妥珠单抗、阿达木单抗和贝伐珠单抗完整质量分析研究中:（1）共鉴定到14种糖型修饰的曲妥珠单抗分子,分子量范围为147600-149126Da。其中,G0F/G1F糖型修饰的曲妥珠单抗分子（分子量为148219 Da）含量最高,还包括G0F/G0F、G1F/G1F等其它含量相对较低的糖型;（2）共鉴定到10种糖型修饰的阿达木单抗分子,分子量范围为147674-148858 Da。其中,G0F/G0F糖型修饰的阿达木单抗分子（分子量为148081 Da）含量最高,还包括GOF/GOF+Lys、G0F/G1F、G1F/G1F等其它含量相对较低的糖型;（3）共鉴定到10种糖型修饰的贝伐珠单抗分子,分子量范围为147752-149846 Da。其中,G0F/G0F糖型修饰的贝伐珠单抗分子（分子量为149198 Da）含量最高,还包括G0F/G1F、G1F/G1F等其它含量相对较低的糖型。将上述三种单抗的分析结果与文献报道相比,建立的非变性和变性完整质量分析方法能够鉴定更多低丰度（<1%）糖型修饰的单抗分子,同时能够鉴定C-末端赖氨酸添加等其他修饰。非变性质谱分析能够使蛋白保持其天然结构,鉴定更多含唾液酸糖型,从而获得更准确的单抗完整质量分析结果。在亚基水平上,通过优化液相梯度条件和质谱CID和ETD碎裂参数,建立了Middle-down分析新方法。建立的分析方法能够在35 min内实现亚基基线分离,进行亚基分子量测定、氨基酸序列验证和N-糖基化修饰分析。基于建立的方法,测得曲妥珠单抗Lc、Fd亚基平均分子量分别为23442.366 Da和25382.794 Da,由G0F修饰的Fc/2亚基平均分子量为25236.626 Da。阿达木单抗Lc、Fd亚基平均分子量分别为23411.667 Da和25457.690 Da,由GOF修饰的Fc/2亚基平均分子量为25204.619 Da。贝伐珠单抗Lc、Fd亚基平均分子量分别为23436.553 Da和25929.795 Da,由G0F修饰的Fc/2亚基平均分子量为25217.655 Da。三种单抗的糖基化位点均位于Fc/2亚基第61位的天冬酰胺残基上,整合CID和ETD技术互补的质谱碎片信息,获得与文献相当的氨基酸序列覆盖度（高达50%）。在肽段水平上建立了 Bottom-up分析新方法,通过优化样品制备,建立的分析方法能够在3 h内制备多肽样品,进行单抗药物氨基酸序列验证和N-糖基化修饰分析。将建立的方法用于三种单抗的糖肽样品分析,鉴定到曲妥珠单抗中20种糖型,阿达木单抗中17种糖型,贝伐珠单抗中15种糖型。对三种单抗的完整肽样品进行分析,测得氨基酸序列覆盖度分别为95.33%、86.62%、96.55%。对糖肽和完整肽样品进行分析均能准确定位单抗的糖基化位点,测得三种单抗的糖基化位点分别位于单抗重链第300、301、303位的天冬酰胺残基上。建立游离N-聚糖分析方法,通过优化样品制备,建立的分析方法能够在30min内快速标记N-聚糖,进行单抗药物N-糖基化修饰分析和批次间差异研究。将建立的方法用于三种单抗的N-糖基化修饰分析中,鉴定到曲妥珠单抗中20种糖型,阿达木单抗中18种糖型,贝伐珠单抗中11种糖型,主要修饰糖型包括G0F-GN、G0、G0F等。与文献报道相比,建立的方法能够鉴定单抗中更多的低丰度糖型（<0.5%,如唾液酸化糖型）。上述四个水平的分析结果能够相互补充、交叉验证,基于质谱技术建立了快速、重复性好、灵敏度高的单抗药物结构表征的分析策略,能够更加全面、可靠地表征单抗结构。宿主细胞蛋白（HCP）是单抗药物中常见的杂质,由生产单抗药物的宿主细胞表达。单抗药物与HCP杂质的浓度水平差异大（甚至超过5个数量级）,常规的质谱仪无法有效鉴定单抗药物中的低丰度HCP杂质,因此HCP杂质分析是当前单抗药物质量分析面临的主要挑战之一。本研究基于纳升液相色谱质谱多级质谱联用技术,通过优化质谱参数、液相梯度条件、样品制备方法,建立了高灵敏度的低丰度HCP杂质定性分析方法,最终分别鉴定了 NISTmAb RM 8671和阿达木单抗中194种和63种HCP杂质。