百合病毒的分子鉴定与重要病毒的检测研究

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百合是重要的经济作物,在我国不仅有悠久的栽培历史,近年来的栽培规模不断扩大,从国外大量引进适合作为鲜切花和高档蔬菜的品种也越来越多,在此同时,百合遭受病毒侵染和衰退的现象也越来越严重。本研究对侵染我国百合的植物病毒进行了系统研究,结果表明黄瓜花叶病毒(CMV)、百合无症病毒(LSV)、百合斑驳病毒(LMoV)是侵染百合的主要病毒病原,李坏死环斑病毒(PNRSV)在百合上也有发生。同时,通过RNA斑点杂交研究了LSV、PNRSV在我国百合上的发生情况。 通过田间调查发现我国百合普遍受到病毒侵染,病毒病症状相当复杂。寄主反应实验表明,侵染百合的植物病毒的寄主范围往往都很窄,难以通过寄主反应对它们进行鉴定。用ELISA检测发现:CMV在我国百合上普遍发生,在64个检测的样品中有25个受到CMV的侵染,侵染率为39.1%;电镜检测结果表明在75个样品中有58个样品被线状病毒侵染,侵染率达77.3%;组织病理学观察结果显示:在40个被线状病毒侵染的样品中有27个样品检测到风轮状内含体,表明受到马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒成员的侵染,侵染率达67.5%。 利用RT-PCR方法,从百合上获得2个CMV分离物(CMV-LS、CMV-ZH)的CP基因序列。序列同源性分析结果表明:CMV-LS、CMV-ZH的CP基因序列与亚组Ⅰ和亚组Ⅱ成员的CP基因序列同源性分别为88.2%~99.7%和68.6%~78.3%;CMV-LS和CMV-ZH的CP基因氨基酸序列与亚组Ⅰ成员和亚组Ⅱ成员CP基因氨基酸序列的同源性分别为94.1%~99.1%和65.7%~78.5%,CMV-LS和CMV-ZH均属于亚组Ⅰ成员;进一步对不同来源的CMV分离物的系统进化树分析结果表明:来自各地百合上的CMV分离物在进化树中单独成簇,形成明显的株系分化趋势,侵染百合的出现寄主适应性变异现象。 利用RT-PCR方法,从百合上获得2个LMoV分离物(LMoV-G、LMoV-X)的3′-末端cDNA片段。序列同源生分析结果表明:LMoV-G、LMoV-X与已报道的百合斑驳病毒分离物核苷酸序列的同源性为85.9%-99.6%,NIb基因序列的同源性为84.7%~100.0%,NIb基因氨基酸序列的同源性为82.9%~100.0%,CP基因序列同源性为85.9%~100.0%、CP基因氨基酸序列同源性为87.0%~100.0%,3′-UTR区核苷酸序列同源 摘要性为93.1%一100.0%。用于侵染百合和郁金香的Po铆l’rus在分类上尚处于混乱不清的现状,本研究结果表明:12个侵染百合和郁金香的尸口铆l’rus可分为三个种:即百合斑驳病毒(LMoV)、郁金香碎色病毒(TBV)和伦布兰特郁金香碎色病毒(ReTBV)。 利用RT-PCR方法,从百合上扩增到两个LSV分离物(LSV-G、LSV-X)的3‘一末端cDNA片段。序列分析结果表明:LS琴G、LSV-X3‘-末端克隆片段长分别为995bp、994bp,包括Cp基因部份序列(1一585bp)和完整的3‘一端16kDa蛋白基因序列(494一916bp),均编码195个氨基酸和141氨基酸。将两分离物与己报道的LSV分离物进行序列同源性分析,在核普酸水平上,各分离物间CP基因序列的同源性为87.5%一99.3%,16kDa基因序列的同源性为98.3%一99.5%;在氨基酸水平上,各分离物间CP基因氨基酸序列的同源性为%.2%~9 9.5%,16kDa基因氨基酸序列的同源性为98.3%一99.5%。以上结果首次发现了LSV在我国百合上的发生。利用RNA斑点杂交方法,在北京检验检疫局提供的6个样品中有3个样品检测到LSV的侵染,检出率为50.0%,在我国浙江丽水采集的25个样品中有14个样品检测到LSV的发生,侵染率达56.0%。以上结果表明:说明进口的百合球茎LSV的侵染率可能较高、LSV在我国也可能己经普遍扩散。 利用 RpPCR方法,从百合上扩增到两个PNRSV分离物(P一299、P一503)的3‘一末端。DNA片段。序列分析结果表明:P一299、P一503片段长分别为452bP、45 lbP,均编码150氨基酸。两分离物与己报道的27个不同来源的PNRSV分离物进行序列同源性分析,P一299、P一503与各分离物的CP基因序列在核普酸水平和氨基酸水平上的同源性分别为84.5%一99.1%和76%一87.3%。以上结果首次发现了 PNRSv在百合上的发生。利用RNA斑点杂交方法进行检测,在北京检验检疫局提供的4个样品中有3个样品检测到PNRSV的侵染,检出率为75 .0%,在我国浙江丽水采集的24个样品中有5个样品检测到PNRSV的发生,侵染率达20.8%,说明PNRSV不仅能够侵染百合,而且在一定程度上普遍发生。
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