被子植物的有性生殖方式对于植物的遗传和育种具有重要的意义。在双受精的起始阶段,亲和花粉落到雌蕊柱头的表面,经过与柱头的相互作用,发生黏附、水合、萌发等过程后长出花粉管。花粉管可穿过柱头进入花柱道,精细胞沿着花粉管进入雌配子体。拟南芥的双受精过程受到雌雄生殖系统之间相互作用的调控。在双受精的起始阶段,授粉过程同样受到花粉与柱头相互作用的调控。参与相互作用的作用因子包括柱头组织中的因子和花粉中的因子。有研究表明,拟南芥花粉的黏附和水合可能受到柱头表面乳突细胞蜡质层和细胞壁的某些成分的调控,而花粉外壁的某些成分,主要为脂类和蛋白质也参与了这一调控过程。研究表明一些花粉外壁定位的脂类和蛋白质的缺失或者表达异常会干扰花粉的水合过程,导致拟南芥雄性不育。但是这些重要因子主要由包裹花粉的绒毡层产生,分泌后通过运输到达花粉外壁,因此这类因子并不是花粉自身产生的。花粉自身基因是否参与花粉与柱头互作并不清楚,需要对其进行深入探究。本论文以花粉的配子体基因NPH（NO POLLEN HYDRATION）突变的拟南芥突变体植株作为研究对象,从突变体不能水合的表型入手,探究NPH基因在拟南芥的花粉与柱头相互作用过程中所发挥的功能。通过对NPH基因的表达模式的研究、亚定位的分析、恢复实验及体外钙离子的验证实验等,尝试探究NPH基因在拟南芥的花粉水合过程中的作用机理。现将实验结果总结如下:1、突变体nph的筛选:本实验室通过T-DNA插入构建了拟南芥突变体文库,我们从其中的雄性不育系中筛选出了花粉有水合缺陷的突变体nph。2、突变体nph表型分析:Alexander染色表明nph花粉形态和活力正常,透射电镜观察花粉外壁的组织和野生型有差异。其花粉在拟南芥正常生长湿度下不能发生水合,但是在高湿度下可水合,花粉管体外萌发实验发现突变体花粉不能萌发。3.基因定位:通过TAIL-PCR技术获得突变体已知序列的侧翼序列,鉴定证明nph突变是T-DNA单拷贝插入突变,并确定NPH基因是钙离子通路中的一个重要基因。构建恢复载体进行互补实验,结果显示,互补系植株的花粉可以正常水合萌发,产生花粉管。说明突变体所表现出的缺陷表型确实是由于NPH基因的突变而产生的。4.NPH蛋白亚细胞定位:生物信息学分析表明NPH基因编码一个钙离子通道蛋白。通过对pro LAT52::NPH-GFP转基因植株的检测,发现NPH蛋白定位于细胞质。5.钙离子指示剂显示钙离子的分布:对野生型植株转入钙离子指示剂,可以在激发光下观察钙离子的积累和浓度梯度。以此为依据进行实验观察,结果显示:在花粉管的尖端,随着花粉管的伸长,钙离子会出现动态地聚集,表明钙离子确实参与到花粉管的生长。6.钙离子通道药物抑制处理:通过在常规花粉萌发培养基中添加一定浓度的钙离子通道抑制剂,再进行花粉培养实验,研究证明体外添加钙离子通道抑制剂可以抑制花粉的萌发和花粉管的生长,表明花粉的萌发和花粉管的生长需要钙离子的参与。