在骨骼肌中,存在着由一个T小管膜和两个内质网/肌浆网扁平囊泡膜组成的膜结构,被称为三联体。与骨骼肌兴奋-收缩偶联相关的钙释放复合物就位于三联体结构中。当神经信号激活肌肉细胞后,动作电位会沿着T小管穿过整个肌纤维膜,激活位于T小管膜上的电压门控钙离子通道二氢吡啶受体,并诱导其产生形变,二氢吡啶受体的形变会进一步激活位于肌浆网膜上的钙离子通道鱼尼丁受体。鱼尼丁受体则将储存在肌浆网内的钙离子中释放到细胞内,进而引起肌肉收缩。位于肌浆网膜上的鱼尼丁受体,是整个复合物的核心。Triadin作为这个复合物的调节器起着重要作用。细胞骨架连接膜蛋白63（CLIMP-63）作为内质网上的常驻蛋白,也位于三联体结构,并且是与triadin相关的配偶体。第一个课题是关于triadin和CLIMP-63的结构与功能性研究。儿茶酚胺敏感性室性心动过速是一种罕见的、具有高死亡率的遗传性心脏病。此疾病无明显病症,常常会在剧烈运动或精神压力大时发作,主要发作对象为儿童和青少年。三联体结构内不同蛋白的基因突变是引起儿茶酚胺敏感性室性心动过速的主要原因。最新研究表明,TRDN基因突变诱导的triadin缺失进而引起的triadin与CLIMP-63之间相互作用的缺失可能是导致儿茶酚胺过敏性室性心动过速的其中一个原因,本课题就是基于这一猜想而开展。目前对于triadin和CLIMP-63这两种蛋白质的研究主要集中在功能上,两个蛋白之间的相互作用也仅是通过免疫共沉淀实验得出结论,具体的结合位点和结合机制并不清楚。因此,我们希望一方面通过等温量热滴定实验确定结合区间并获得详细热力学参数,另一方面通过应用X射线晶体学的方法从结构角度进一步解释结合机制。据报道CLIMP-63只有1种亚型,而triadin至少有经可变剪切而产生的4种亚型。我们人工合成了经过大肠杆菌表达体系密码子优化的人源CLIMP-63膜内片段基因和triadin最长亚型的膜内片段基因。以合成的基因为模板,根据二级结构预测结果、相关研究报道以及适宜蛋白折叠表达的相关要求,通过聚合酶链式反应扩增不同的目的基因。将目的基因通过经特殊设计的引物克隆到含有组氨酸标签、麦芽糖结合蛋白、TEV酶切位点的HMT载体中。将重组质粒转化到大肠杆菌中,使目的基因在大肠杆菌中表达,并通过镍柱、TEV过夜酶切、麦芽糖柱、钴柱、阴阳离子交换柱以及凝胶色谱进行纯化。根据实验的要求确定蛋白质是否需要切除标签。例如,蛋白结晶实验需要得到不带任何标签且具有高纯度的目的蛋白,而进行等温量热滴定实验的蛋白则可以不切除标签并适当减少纯化步骤。在结构研究中,经生物信息学预测后,发现CLIMP-63的膜内部分总共包含3个卷曲螺旋区间,分别标记为CC1、CC2、CC3结构域。在CLIMP-63的结晶筛选过程中,总共筛选了五种不同结构域组合的野生型CLIPM-63和四种降低表面熵值的CLIMP-63 CC2结构域突变体。在经过480个结晶条件的筛选后,野生型CLIMP-63 CC3结构域显现出良好的结晶特性,总共有14个条件出现晶体。在经蛋白晶体染料确认为蛋白晶体后,分别对长有不同形状晶体的条件进行优化,最终总共得到两种不同形状的多面体晶体。本实验采用同晶置换和异常散射的组合方法,通过利用碘原子和硒原子等重原子的强散射能力确定其在晶胞中的坐标,进而求解出衍射相位。因此,又制备了另外两种晶体。制备含碘原子蛋白晶体,实验中通过采用将不同浓度的碘离子加入到原始结晶条件中重新结晶和将原有野生型晶体按梯度浸泡到含有不同浓度碘离子的结晶溶液中两种方法,最终得到了含有最高碘离子浓度为1.2摩尔的蛋白晶体。而制备含有硒原子蛋白晶体,需要在蛋白表达过程中用硒代甲硫氨酸代替原培养基中的甲硫氨酸。因此,本实验中采用的是PASM-5052自诱导培养基,分别加入除半胱氨酸和酪氨酸之外的18种氨基酸和硒代甲硫氨酸,蛋白纯化方法与野生型一致。在经结晶条件筛选后并无晶体生长,后采用晶种法,利用野生型晶体作为晶种进行结晶,经过蛋白浓度与深孔溶液浓度的双重优化之后,最终得到含有硒原子的蛋白晶体。根据衍射波长范围及衍射数据重复度要求的不同,分别将得到的CLIMP-63 CC3结构域野生型和含有硒原子、碘原子的晶体分别在上海光源和天津大学药学院进行衍射试验。根据衍射结果,确定两种形状的晶体均为R3空间群,晶格参数为a=35.803?,b=35.803?,c=450.085?,α=β=90.00°,γ=120°,分别得到了分辨率为1.9?、2.8?和3.0?的野生型晶体数据、含碘原子晶体数据以及含硒原子晶体数据。将得到的晶体数据利用PHENIX软件进行分析后发现,晶体的最小非对称单元内含有两个蛋白分子。然而,由于晶格过长导致衍射点相互叠加,无法区分,因而无法顺利解决衍射相位问题进而解析出CLIMP-63 CC3结构域的结构。后续我们将采用以麦芽糖结合蛋白作为融合蛋白的方法继续对此片段进行结晶试验。通过此方法寻找其他晶型的晶体,从而进一步解析蛋白晶体结构。同时,我们通过组合不同的降低表面熵值突变的方式优化出了具有高结晶性的、总共带有5个表面突变的CLIMP-63CC2结构域突变体。目前已初步得到蛋白晶体,但晶体的质量还不足以进行X射线衍射。接下来我们将进一步优化结晶条件以得到可以进行衍射的晶体。在功能研究中,为进一步确定CLIMP-63与野生型triadin的结合区间,我们通过等温量热滴定实验逐渐缩短CLIMP-63的长度。目前已经初步确定了可以与野生型triadin结合的最小CLIMP-63片段为CLIMP-63 CC3结构域。实验结果显示,两个蛋白之间的解离常数为16微摩尔,说明两个蛋白之间确实存在着强结合。CLIMP-63与野生型triadin之间的结合鉴定为CLIMP-63与可导致儿茶酚胺敏感性室性心动过速的triadin突变体之间的相互作用建立了对照体系。目前,已经制备了两种triadin突变体,triadin＿G991A和triadin＿G1016A。这两种triadin突变体和CLIMP-63 CC3结构域的等温量热滴定实验正在进行中。因此,Triadin和CLIMP-63之间相互作用的缺失是否为导致儿茶酚胺过敏性室性心动过速的原因将被进一步确定。同时,我们会通过等温量热滴定实验进一步缩短两个蛋白的结合区间并最后通过丙氨酸扫描的方法最终确定结合位点。此外,结合等温量热滴定实验结果以及带有标签时CLIMP-63的聚集形式,我们建立了CLIMP-63与triadin相互作用的结构模型。模型中,CLIMP-63为四聚体结构,triadin为单体结构。其中CLIMP-63的CC3结构域在与triadin的结合过程中起到关键作用。另一个课题是关于昆虫鱼尼丁受体对二酰胺类杀虫剂抗性机制的研究。一直以来,农业害虫所带来的经济损失始终不容忽视。已有杀虫剂的高毒害性以及当下农业害虫所产生的抗药性,使得科学家们不断寻找新的作用靶点并进行绿色农药的开发。随着研究的不断深入,鱼尼丁受体被开发为新型杀虫剂的作用靶点。鱼尼丁受体是内质网/肌浆网中最大的钙离子通道蛋白,是储存在内质网/肌浆网中的钙离子流入细胞内的必经之路。因此,鱼尼丁受体在骨骼肌的兴奋收缩过程中发挥着不可替代的作用。在哺乳动物中,鱼尼丁受体有三种不同亚型即Ry R1、Ry R2和Ry R3,分别分布在骨骼肌、心肌和不同组织中。而昆虫中的鱼尼丁受体只有一种亚型,在序列上与哺乳动物的Ry R2更为接近。因此,以鱼尼丁受体为作用靶点的新型二酰胺杀虫剂具有更高的物种选择性。新型二酰胺杀虫剂自研发成功后便被广泛使用,但随着使用规模的不断扩大,昆虫对其产生的抗药性也愈发明显,对于抗药性产生的机制研究十分紧迫。尽管目前已经利用冷冻电镜和蛋白晶体解析出许多物种的鱼尼丁受体结构,但仅局限于哺乳动物。目前还没有关于昆虫鱼尼丁受体结构的研究,这使得新型二酰胺类杀虫剂作用的分子机制尚不清楚,同时也缺乏合理改良杀虫剂的依据。为了改变这一现状,我们选取了农业害虫小菜蛾作为研究对象,通过晶体结构学对昆虫鱼尼丁受体的结构进行了首次研究。实验中所用到的小菜蛾为福州敏感品系,以提取的基因组RNA为模板进行反转录,进而获得c DNA。以此c DNA为模板进行聚合酶链式反应以完成目的基因的扩增,并经过T4 DNA聚合酶处理后连入HMT载体构成重组质粒。将重组质粒转化到大肠杆菌中,使目的基因在大肠杆菌中表达,并通过镍柱、TEV过夜酶切、麦芽糖柱、钴柱、阴阳离子交换柱以及凝胶色谱进行纯化,最终得到不带有任何标签且具有高纯度的目的蛋白以用于后续得结晶实验。在经过480个结晶条件的筛选后,共计有11个条件得到小菜蛾鱼尼丁受体A结构域晶体。确认为蛋白晶体并经过条件优化后,将晶体送往上海光源进行衍射实验。根据衍射结果,可确定晶体的空间群为P61,晶格参数为a=170.13?,b=170.13?,c=51.763?,α=β=90.00°,γ=120°,分辨率为2.8?。将得到的晶体数据利用PHENIX软件进行分析后发现,晶体的最小非对称单元内含有两个蛋白分子,溶剂含量高达72.8%,解释了晶体容易破碎的原因。之后以小鼠鱼尼丁受体A结构域的晶体结构为模板进行分子置换以求解衍射相位,随后利用Coot软件不断进行结构修正,最终成功解析了重要农业害虫小菜蛾鱼尼丁受体A结构域的高分辨率（2.84?）晶体结构。从结构上看,最小非对称单元中两个蛋白分子的结构基本一致。蛋白分子整体为三叶草结构,主要由12个β折叠紧密结合而成。在β4两端为两个螺旋结构α1和3₁₀1,螺旋α1的另一端与一段缺少电子云走向的、活动性较强的loop相连。观察蛋白的电荷分布图可以发现,整个蛋白表面负电荷占绝大比例,与蛋白的等电点相吻合。将小菜蛾、小鼠和家兔的鱼尼丁受体A结构域的晶体结构进行比对后,可以发现,除β1-β2以及loop4存在距离偏差外,总体结构十分相似。另外,小菜蛾鱼尼丁受体A结构域的第35和63位的两个半胱氨酸形成了二硫键,但哺乳动物虽也有两个半胱氨酸却未形成二硫键。接下来,我们将从结构学的角度,通过基于荧光的热稳定性试验验证此二硫键对于蛋白结构稳定性的影响。此外,鱼尼丁受体A结构域是组成鱼尼丁受体N末端门控环的三个独立结构域之一,其他两个分别为B结构域和C结构域。为了更好地了解小菜蛾鱼尼丁受体N末端门控环,我们将利用同源建模得到小菜蛾鱼尼丁受体N末端B、C两个结构域的结构模型。叠加小菜蛾鱼尼丁受体N末端A结构域晶体结构后,将与哺乳动物的鱼尼丁受体N末端门控环进行结构比对,并根据二者的结构差异进行药物设计与筛选。