利用抑制剂对人参皂苷生物合成途径MVA与MEP的研究

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人参皂苷是人参的主要有效成分,具有抗衰老、提高免疫力等诸多功效,对癌症的预防和治疗也具有一定的效果,应用十分广泛。采用代谢工程手段调控人参皂苷的生物合成,提高人参皂苷含量,是改善人参内在品质的有效方法。目前,人们对人参皂苷生物合成机理的研究尚处于初始阶段,对于推测的途径还存在很多不确定性。自甲羟戊酸(MVA)途径被发现以来,人们一般认为人参皂苷是经由MVA途径合成的,而对于人参中是否存在MEP途径(又称丙酮酸途径)的研究,目前尚无报道。本研究以人参发根为试验材料,采用向培养基中分别添加甲羟戊酸途径(MVA)的抑制剂洛伐他汀和非甲羟戊酸途径(MEP)的抑制剂膦胺霉素的方法,通过检测人参发根总皂苷和单体皂苷含量,人参皂苷前体达玛烯二醇含量,以及MVA和MEP途径关键酶活性的变化,探讨人参皂苷的生物合成是否存在MVA及MEP途径,以及两途径的关系等问题,为人参皂苷的代谢工程研究及破解人参皂苷生物合成机制奠定基础。研究结果如下:1.针对人参发根多糖含量偏高的问题,对人参发根总皂苷及单体皂苷(Rg1、Re和Rb1)的提取和含量测定方法进行了优化,确定了适宜的提取和含量测定方法。2.通过抑制剂在不同浓度及饲喂时间下对人参发根生长影响的研究,确定洛伐他汀和膦胺霉素浓度分别低于50μmol/L和30μmol/L时,对人参发根生长没有不良影响,抑制剂饲喂时间控制在7天内较适宜。3.试验条件下,洛伐他汀对人参总皂苷生物合成的最高抑制率为57.93%,膦胺霉素对人参总皂苷生物合成的最高抑制率为42.17%,说明人参皂苷合成中存在MVA和MEP途径,并推测MVA途径在人参皂苷的生物合成中占主要作用。4.通过对人参发根中单体皂苷Rg1、Re和Rb1含量的分析,发现与抑制剂对总皂苷的抑制规律大致相同,洛伐他汀对人参单体皂苷Rg1、Re和Rb1的最高抑制率依次为50.40%、66.65%、40.12%,膦胺霉素对人参单体皂苷Rg1、Re和Rb1的最高抑制率依次为38.54%、38.84%、19.51%,表明不同类型皂苷积累速度不同。5.当用洛伐他汀对人参发根进行处理时,达玛烯二醇的合成受到抑制,最高抑制率可达64.58%,而膦胺霉素对达玛烯二醇的最高抑制率可达46.83%,这与总皂苷含量变化规律较符合。6.通过洛伐他汀处理下HMGR酶活的测定发现,洛伐他汀对该酶活性的最大抑制率为96.82%,对照组HMGR酶的最高酶活力可达10.393U/mg;膦胺霉素处理下对DXR酶活力测定发现,膦胺霉素对该酶的最高抑制率可达96.25%,对照组DXR酶活力最高可达0.266U/mg。
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