研究背景细胞外基质在维持心脏结构完整性和正常的收缩舒张功能中起重要的作用。心肌纤维化主要表现为细胞外基质胶原分泌和降解的失衡,导致胶原异常的过度沉积,心肌室壁僵硬和顺应性下降,早期可表现为单纯左室舒张功能受损,后期则合并收缩功能降低,严重影响心脏功能,并最终进展为心力衰竭。另外,心肌组织结构的异常改变为恶性心律失常的发生提供了解剖学基础,易导致猝死的发生。心肌纤维化发生时,胶原纤维的生成增多而降解减少。大量胶原纤维的生成与肌成纤维细胞的活化明显相关。正常心肌组织中并不存在肌成纤维细胞,它是心脏在心肌梗死或压力超负荷等各种因素刺激下由多种细胞类型转分化而来的,主要标志为α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达。研究表明,心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化在心肌纤维化的发生发展中起主导作用。成纤维细胞可在各种炎性介质,细胞因子,机械张力等因素的刺激下分化为肌成纤维细胞,其分泌更多胶原纤维以促进心室重构,若持续活化,则导致心肌间质纤维化。近年来,如何特异性抑制肌成纤维细胞转分化成为研究热点。SIRT3是存在于线粒体中的NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶,广泛表达于心肌,肝脏,肾脏,棕色脂肪组织等代谢旺盛的组织,参与细胞衰老、分化、凋亡及能量代谢等过程。既往研究表明,SIRT3基因敲除小鼠随年龄增长会出现自发性心肌肥厚,间质纤维化及收缩功能异常,在压力超负荷刺激下较野生型小鼠发生更严重的心肌肥厚及心肌纤维化。其可能的机制是SIRT3可通过去乙酰化并增加转录因子FOX03a表达,而后者则进一步促进MnSOD和IDH2表达减轻氧化应激对细胞的损伤,从而延缓心肌肥厚的发生。SIRT3通过去乙酰化GSK3β降低TGF-β合成从而延缓衰老相关的各器官纤维化。尽管有相关的类似研究,但SIRT3与心脏成纤维细胞转分化的关系及延缓心肌纤维化发生发展的机制尚不阐明,需开展更多的实验研究探讨。活化T细胞核因子(NFAT)是具有多效调节功能的转录因子,主要由钙-钙调磷酸酶信号通路激活,从而发挥调控基因表达的作用,其在平滑肌细胞中调控着 α-SMA 的表达。研究表明 TRPC6(syndecan-4)-Calcineurin-NFAT 通路可促进心脏成纤维细胞转分化,在心肌纤维化的发展中起重要作用。NFAT家族包括 NFAT1(NFATc2)、NFAT2(NFATcorNFATc1)、NFAT3(NFATc4)、NFAT4(NFATc3)。其中NFATc4可促进成纤维细胞分化,但NFATc2的作用尚不明确,既往研究表明在压力超负荷刺激下,NFATc2基因敲除小鼠较野生型小鼠左室纤维化程度减轻。在一项有关肺动脉高压的研究中,SIRT3敲除可激活信号转导和转录活化因子(STAT3)并促进其核转位从而影响其转录活性,在肺平滑肌细胞中NFATc2的表达量和活性均受STAT3调控。STAT3是STAT家族的重要成员,是JAK-STAT信号通路中的重要一员,对肿瘤的发生起促进作用。在所有STAT家族成员中,STAT3与心血管系统的关系最为密切,且既往研究表明STAT3有促进心肌纤维化的作用。作为一个穿梭在线粒体及细胞核的转录因子,STAT3具有乙酰化位点,SIRT3能否通过去乙酰化STAT3而影响其活性,进而影响其下游通路分子NFATc2,这三种分子的相互关系及在心肌纤维化发生发展的进程中的作用,值得进一步探讨。综上所述,本研究拟通过体内和体外实验两部分探讨SIRT3在血管紧张素II诱导的心肌纤维化中作用及可能涉及的信号通路,为临床预防治疗甚至逆转心肌纤维化带来新的治疗思路,为以SIRT3为靶点的新型药物设计提供实验依据。研究目的1.明确SIRT3-/-小鼠在血管紧张素Ⅱ刺激下较野生型小鼠是否发生更严重的心肌纤维化2.探讨SIRT3是否在心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化中发挥作用3.探讨SIRT3抑制肌成纤维细胞转分化中可能的分子机制,明确STAT3-NFATc2信号通路的作用研究方法1.动物模型构建选用适龄129及SIRT3-/-小鼠各30只建模分4组,每组15只。采用皮下埋入AngⅡ微量泵(2000ng/kg/min)28天构建心肌纤维化模型。2.小鼠乳鼠原代心脏成纤维细胞的分离及培养提取1-3天新生KM及SIRT3-/-小鼠心脏中的成纤维细胞(CFs)。于含有10%胎牛血清和双联抗生素的高糖DMEM培养基中培养,并将细胞放置于恒温37℃,含5%C02的细胞培养箱中培养。3.细胞干预采用Ang Ⅱ(10-7 mol/L 48h)刺激诱导WT及SIRT3-/-脏成纤维细胞转分化,病毒转染野生型CFs过表达SIRT3观察成纤维细胞转分化率,在SIRT3-/-CFs采用si-RNA沉默STAT3并观察下游分子NFATc2及α-SMA的表达。4.蛋白印迹收集各组动物组织以及细胞,提取总蛋白,BCA试剂盒检测蛋白浓度后,进行SDS-PAGE。电泳后,采用湿转法将蛋白转移到PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭2h,分别用特异性一抗4℃摇床孵育过夜。次日用兔或鼠二抗室温孵育1小时后用AI600发光仪显影。5.组织病理学染色及组化分析各组动物心脏取材,浸泡于4%多聚甲醛,脱水,石蜡包埋切片。制成厚约5um的石蜡切片,用于后续的H.E、Masson及天狼猩红染色。组化分析:选取切片后,脱蜡,抗原修复,后用相应的一抗4℃孵育过夜;次日选用适当二抗37℃孵育1h,DAB显色,显微镜下观察。6.细胞免疫荧光法将细胞爬片置于固定液中25min,用0.5%Triton打孔20min,后用1%BSA封闭30min,加入特异性一抗,4℃孵育过夜。次日,加入相应的免疫荧光二抗37℃孵育1h(避光);DAPI染核5min,抗荧光淬灭剂封片后采用荧光显微镜观察。7.统计学分析采用GraphPad6统计分析数据,每组实验至少重复3次,所有数据均采用x±s表示。t检验分析被用来评估组间差异,多组之间的差异采用单因素方差分析法(oneway-ANOVA)。P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.Ang Ⅱ刺激后,SIRT3-/-小鼠较WT小鼠发生更严重的心肌纤维化为研究SIRT3在心脏纤维化中的作用,我们分别给予野生型(WT)和SIRT3-/-(SIRT3-/-)小鼠为期4周的AngⅡ持续泵入。Western blot结果显示,与对照组相比,应用AngⅡ持续泵入的野生型小鼠SIRT3的表达量约下降了 21%(P<0.05)。进一步的HE染色显示,应用AngⅡ的小鼠心脏横截面积增大,心肌细胞缺失增多,特别是SIRT3-/-组。Masson和天狼猩红染色表明,SIRT3-/-比野生型小鼠的心肌纤维化指数要高,这种差异在应用AngⅡ泵入后更加明显(P<0.05)。免疫组化结果示SIRT3-/-+AngⅡ小鼠表现出Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的大量沉积(P<0.05),Western blot也证实了这一现象。总之,这些结果表明,SIRT3可能参与到预防小鼠心脏胶原纤维沉积和心肌纤维化。2.SIRT3-/-WT心脏成纤维细胞更多地转分化为肌成纤维细胞我们在SIRT3-/-小鼠心肌组织中检测到更多的α-SMA,标志着更多肌成纤维细胞分化生成。为进一步研究SIRT3在肌成纤维细胞分化中的作用,我们分别从新生的WT和SIRT3-/-小鼠中分离出成纤维细胞。Western blot和细胞免疫荧光分析表明,SIRT3-/-的心脏成纤维细胞表达更多的α-SMA、Ⅰ型胶原和纤连蛋白(P<0.05),这表明SIRT3-/-成纤维细胞以自发的方式分化为肌成纤维细胞。我们用SIRT3慢病毒转染了 WT成纤维细胞,随着SIRT3表达的升高,α-SMA和Ⅰ型胶原的表达下降(P<0.05)。总之,我们的数据表明,SIRT3在抑制心脏成纤维细胞转分化方面起着重要作用。3.AngⅡ刺激后的SIRT3-/-心脏成纤维细胞获得更明显的表型转化我们用AngⅡ刺激了 WT和SIRT3-/-心脏成纤维细胞。由AngⅡ刺激的SIRT3-/-成纤维细胞表达最多的α-SMA、胶原纤维和纤连蛋白(P<0.05)。与对照组相比,SIRT3-/-的小鼠心脏蛋白和肌纤维细胞的Western blot结果均表达更高的TGF-β(P<0.05)。TGF-β通过促进心脏成纤维细胞转分化在纤维化发生发展中扮演着重要的角色。我们的研究结果表明,TGF-β生成与SIRT3敲除诱发的心脏成纤维细胞转分化之间存在正反馈关系。4.SIRT3可去乙酰化STAT3,并抑制其活性虽然上述结果表明SIRT3可以调节成纤维细胞的转分化,但其内在机制仍不清楚。研究表明,与对照组相比,在SIRT3-/-肌成纤维细胞中,p-STAT3/STAT3的比例更高,这意味着STAT3更多的活化(P<0.05)。SIRT3过表达后逆转了这种现象。我们假设,SIRT3可通过去乙酰化STAT3以调节其活性。Western blot结果示SIRT3敲除后,STAT3的乙酰化水平明显升高,而过表达SIRT3后,STAT3的乙酰化水平明显降低,几乎检测不到(P<0.05)。免疫共沉淀示,SIRT3和STAT3二者之间存在直接交互作用。据此可推断,SIRT3可直接去乙酰化STAT3并抑制其活性。5.SIRT3-/-肌成纤维细胞中NFATc2的表达和核转位均增加我们观察到与对照组相比,SIRT3-/-肌成纤维细胞中NFATc2表达增多,而在SIRT3过表达后NFATc2明显降低(P<0.05)。并且SIRT3敲除促进了转录因子NFATc2在成纤维细胞中的核转位。在SIRT3-/-成纤维细胞中转染si-STAT3并干扰掉STAT3后,NFATc2及α-SMA表达量均明显减少(P<0.05)。这些结果表明,STAT3-NFATc2信号通路参与到肌成纤维细胞转分化过程中。研究结论1.SIRT3可以改善血管紧张素Ⅱ诱导的心肌纤维化2.SIRT3改善心肌纤维化的作用与抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化有关3.SIRT3抑制成纤维细胞转分化的作用机制部分是通过抑制STAT3-NFATc2信号通路实现的研究背景随着高热量饮食和久坐不动生活习惯的流行,肥胖已逐渐成为令人堪忧的全球性健康问题。流行病学调查发现:发病率日益增加的肥胖与心力衰竭发生发展有密切关系。1973,Smith and Willius首次明确肥胖和心室功能存在某种内在关联。Hubert及同事的研究证实过度肥胖可以影响心室功能,并确认肥胖是心力衰竭的一个主要危险因素。最近研究表明在轻至中度肥胖人群已有心脏结构和功能异常,故肥胖相关的心肌重构应定义为肥胖个体中存在的不能用糖尿病、高血压、冠状动脉疾病或其他病因解释的心肌病变。它的临床表现广泛,可从无症状左心室功能障碍发展到症状明显的扩张型心肌病。肥胖相关的心肌重构的主要病因及发病机制尚未明确。目前比较明确的是血流动力学异常(高血流动力学状态)引起的心室负荷加大,继而引起左室肥厚和心室扩张。最主要的组织学特征就是弥漫性的心肌细胞肥大、细胞凋亡增多,在动物模型和肥胖的临床研究中均发现明显的纤维化,且在动物模型中,这样的纤维化往往伴随着组织变性和炎症反应。沉默信息调节因子(Sirtuins)是一类依赖NAD+的组蛋白去乙酰化酶,主要表达于肝脏、肾脏、脂肪等代谢旺盛的组织,调节多种重要的细胞功能。SIRT有7种不同的亚型,其中SIRT3是唯一被发现与人类寿命延长有关的亚型,运动及限制热量摄入能提高SIRT3的表达水平。SIRT3广泛存在于线粒体和细胞核中,在脂肪酸氧化及维持细胞ATP水平方面发挥重要作用。本课题组长期致力于研究SIRT3在心血管系统的保护作用。我们前期研究发现在压力超负荷刺激下,SIRT3基因敲除小鼠较野生型小鼠表现出更为严重的心肌肥厚及心肌细胞能量代谢障碍;可能与LCAD乙酰化水平升高活性降低有关。在既往一项肥胖相关研究中发现SIRT3敲除后可能通过减少心肌组织血管新生影响心肌重构继而恶化心功能。肥胖本身即处于一种慢性炎症状态,SIRT3是否通过影响炎症因子的表达及释放进而进一步影响心脏结构和功能尚未见报道,值得深入研究探讨。在高脂肪饮食诱导的肥胖小鼠脂肪组织中,测量发现单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA的表达明显升高,同时伴有巨噬细胞的大量聚集。在体外培养的肾近曲小管细胞中进行的研究中,SIRT3被证实与MCP-1的mRNA呈负相关,即干扰掉SIRT3后MCP-1的表达呈上升趋势。然而,MCP-1在高脂饮食喂养的肥胖小鼠心脏的作用尚不明确,它是否单独影响心脏炎症因子浸润,况且其与SIRT3是否有内在关联及二者对肥胖小鼠心脏重构的联合作用目前尚无相关报道。其他炎性因子如IL-6、TGF-β、TNF-α在动脉粥样硬化的发生发展中均起到重要作用,那它们在高脂诱导的肥胖模型中是否同样高表达,其与SIRT3的关系,及对心脏结构和心脏功能的影响让人深思,需要进一步研究验证。基于以上理论及研究基础,我们设计并实施了目前的实验。在这项研究中,我们给予雄性野生型和SIRT3基因敲除小鼠喂养了普通饮食或高脂饮食16周,成功建模后首先研究心脏表型。进一步的研究点主要集中在SIRT3通过作用于心脏炎症和纤维化对心脏重构的影响,最后,对该病理生理过程的发病机制和涉及的信号通路进行了进一步的研究。希望我们的研究数据能够提供相关的实验证据,为将来临床上开发有前景的治疗肥胖相关的心肌重构的药物提供一定的基础依据。研究目的1.明确SIRT3对肥胖相关的心肌重构的作用。2.探讨SIRT3改善肥胖相关的心肌重构的机制,如炎症因子释放、心肌纤维化的改变等。3.阐明SIRT3通过调节ROS-NF-κB信号通路减少心肌组织MCP-1的表达及炎性巨噬细胞浸润,继而减轻心肌炎症和心肌纤维化的发生,最终改善肥胖相关的心肌重构和心功能。研究方法1.动物模型构建选用适龄129及SIRT3-/-小鼠各30只建模分4组,每组15只。分别喂养普通饮食及高脂饮食 16 周(60%kcal,D12492;(New Brunswick,NJ,USA)构建肥胖模型。2.超声心动图取材前,先由对本课题内容不知情的专门技术人员以Vevo770小动物超声仪进行超声检测。先采用吸入1%的异氟烷法进行小鼠麻醉,分别应用M-超、二维、脉冲波(PW)多普勒和组织多普勒成像(TDI)记录各项参数,如室间隔厚度(IVST)、左室后壁厚度(LVPWT)、左室收缩、舒张末期内径及容积(LVESD,LVESV,LVEDD,LVEDV)、左室射血分数(LVEF)、E/A、E’/A’等。3.组织病理学染色及组化分析各组动物心脏取材后,组织浸泡于4%多聚甲醛,流水冲洗后P2程序脱水,石蜡包埋备用。用切片机制成厚约Sum的石蜡切片,用于后续的组织病理学染色。组化分析:选取切片后,脱蜡至水,抗原修复,后用相应的一抗4℃孵育过夜,次日选用适当二抗37℃孵育1h,后采用DAB法显色,镜下观察直至棕黄色颗粒出现中止反应。4.蛋白印迹收集各组动物心脏组织总蛋白,适当减少上样量。电泳后,采用湿转法将蛋白转移到PVDF膜上,5%脱脂奶粉室温封闭2h,分别用特异性一抗4℃摇床孵育过夜。次日用相应的兔或鼠二抗室温孵育1小时,TBST充分洗涤后用自动发光仪显色发光。9.实时定量PCR采用Trizol法提取各组心脏组织中的RNA,分别检测其浓度与纯度,并在适当条件下逆转录为cDNA,采用SYBR green法检测各目的基因的表达量。10.DHE染色新鲜取材的小鼠心脏立即用OCT化合物冰冻,迅速制成厚约Sum的冰冻切片。染色前切片先在PBS浸泡5分钟,后在暗室中用浓度为0.5mM的DHE溶液孵育15分钟。再用PBS溶液充分洗涤后,尽早用荧光显微镜拍照留取图像11.统计学分析采用GraphPad6(Windows,GraphPad软件的5.00版本)分析数据,每组实验至少重复3次,所有数据均采用x±s表示。t检验分析被用来评估组间差异,多组之间的差异采用单因素方差分析法(one way-ANOVA)。P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.相比于对照组,高脂喂养的SIRT3-/-小鼠体重增加明显,心脏左室舒张功能减退为了研究SIRT3在肥胖相关的心脏重构中的作用,我们给予野生型和SIRT3-/-小鼠高脂肪饮食持续喂养16周。如表1所示,在高脂喂养的SIRT3-/-小鼠中,体重和心重/体重比均明显增加(P<0.05)。超声心动图显示,高脂饮食引起左心室肥大和舒张功能减退(P<0.05),特别是在SIRT3-/-小鼠;两组小鼠收缩功能无明显差异。2.高脂饮食喂养后,SIRT3-/-小鼠的心肌纤维化更加明显首先,我们测量了所有小鼠心脏的SIRT3蛋白水平。Western blot证实,野生型小鼠在高脂饮食喂养后,SIRT3表达量下降了 19%(P<0.05)。Masson三联染色结果显示,SIRT3-/-小鼠的基础纤维化指数高于野生型小鼠,这种差异在高脂饮食喂养后进一步增加(P<0.05)。对小鼠心脏切片的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原免疫组化染色结果发现,高脂饮食喂养的SIRT3-/-小鼠组胶原蛋白累积最多最明显(P<0.05)。Western blot分析也印证了这一发现。综上这些结果表明,SIRT3可能参与预防与肥胖有关的心脏重构的胶原蛋白沉积和心脏纤维化。3.高脂饮食喂养的SIRT3-/-小鼠心脏炎性因子的表达量最多我们用Western blot测量并比较了各组小鼠心脏炎性因子的表达,包括IL-6、TGF-β、TNF-α、IL-10。结果表明,在高脂饮食喂食的小鼠中,有更多的促炎细胞因子表达,尤其是在SIRT3-/-小鼠中(P<0.05)。相反,抗炎因子IL-10在高脂饮食喂养的SIRT3-/-小鼠中表达最少(P<0.05)。PCR分析与Western blot趋势一致。4.高脂喂养的SIRT3-/-小鼠心脏MCP-1表达和巨噬细胞浸润最多为进一步阐明心脏纤维化和炎症与肥胖相关的心脏重构的潜在关系,我们进行了更多的实验。免疫组织化学染色和Western blot结果均显示,在高脂喂养的SIRT3-/-小鼠心肌组织中,MCP-1的表达量最多(P<0.05)。HE染色显示,高脂饮食喂养的小鼠心脏中有更多的心肌细胞丢失和炎症细胞积累,特别是SIRT3-/-组(P<0.05)。进一步的免疫组织化学证实炎症细胞是MOMA-2染色标记的巨噬细胞。5.我们在高脂饮食喂养的SIRT3-/-小鼠体内观察到最多的ROS生成和活化的 NF-κB我们通过测量p-NF-κB以及NF-κB核转位来测定转录因子NF-κB的活化状况。DHE染色冰冻切片法用来评估心脏组织中ROS的生成量,结果表明高脂饮食喂养的小鼠心脏中有更多的ROS生成和活化的NF-κB,尤其是在SIRT3-/-组中(P<0.05)。研究结论1.SIRT3可减轻肥胖相关的心肌重构,并改善心脏舒张功能2.SIRT3改善心肌重构和心功能的机制,可能与减少炎症因子释放、改善心肌纤维化等有关。3.SIRT3可能通过抑制ROS-NF-κB信号通路减少心肌组织中MCP-1的表达及巨噬细胞浸润,减轻心肌炎症和心肌纤维化的发生,最终改善肥胖相关的心肌重构和心脏功能。