食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。近年来，虽然食管癌的诊断和治疗方法有所进步，但患者的总体预后仍不理想。在食管癌侵袭转移过程中，淋巴管生成、淋巴结转移发挥了重要作用，是影响食管癌患者预后的独立危险因素之一。然而，目前关于食管癌淋巴管生成的机制尚不明确。　　PGRN(progranulin)是类生长因子样分泌蛋白，在神经营养、炎症反应等方面发挥重要作用。在肿瘤中，PGRN被发现在结直肠癌和卵巢癌等肿瘤中高表达，与患者的不良预后密切相关。PGRN主要通过细胞内蛋白激酶B(PKB/AKT)、细胞外信号调节激酶(ERK)等信号通路在肿瘤的增殖、迁移、血管生成和恶性转化等方面发挥作用。但是，食管癌中PGRN的表达情况及其对食管癌淋巴管生成作用的影响，尚不清楚。　　VEGF-C是调节肿瘤淋巴管生成的重要因子，可以通过激活VEGFR-3促进淋巴管的形成和生长，与食管癌等肿瘤组织中的淋巴管密度(LMVD)和淋巴结转移密切相关。有意思的是，研究发现，VEGF-C是磷酸化的ERK、AKT和JNK通路的下游信号。PGRN对这些信号通堕的调控是否可以影响VEGF-C的表达，从而影响食管癌的淋巴管生成等问题亦有待研究。　　研究目的：　　明确PGRN在食管癌中的表达情况，探讨其对食管癌淋巴管生成的作用及其可能机制，分析PGRN在食管癌中的表达对患者预后的影响并建立预后预测模型。　　研究方法：　　1.RT-PCR、Western blot检测PGRN及淋巴管生成因子VEGF-C在不同EC细胞系包括TE-1，Eca109，K410，K450中的表达。　　2.免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)检测PGRN在食管癌组织的表达，并进一步分析食管癌组织中PGRN表达与患者临床参数的关系。检测Ki67和D2-40在食管癌组织中的表达，并分析PGRN与ki67表达和淋巴管密度(LMVD)、淋巴管侵犯(LVSI)的相关性。　　3.用p-GPU6/GFP/Neo/PGRN质粒或空载体转染食管癌细胞TE-1，获得干扰PGRN表达的食管癌细胞TE-1-PGRN-sh及对照细胞株TE-1-NC-sh;用pEZ-M61/GFP/PGRN质粒或空载体转染食管癌细胞TE-1，获得过表达PGRN的细胞株TE-1-PGRN-vector及对照细胞株TE-1-NC-vector。RT-PCR、Western blot确定转染效率。在TE-1细胞中分别下调和上调PGRN表达后，使用PT-PCR、Western blot方法检测VEGF-C的变化。　　4.磷酸化ERK、AKT和JNK被认为是VEGF-C的上游信号。Western blot方法检测PGRN对ERK、AKT和JNK磷酸化水平的影响，并筛选出PGRN-vector对这些上游信号的效果。筛选出通路信号靶点后，加入相应的通路阻滞剂，检测PGRN诱导的VEGF-C表达的变化，以明确PGRN调节VEGF-C的信号通路。　　5.免疫组织化学检测VEGF-C、p-ERK、AKT、p-AKT在食管癌组织中的表达，并分析PGRN与VEGF-C、p-ERK、AKT、p-AKT的相关性。　　6.应用Kaplan-Meier曲线分析高PGRN和低PGRN表达食管癌患者的总生存期(overall survival，OS)和无进展生存期(progression free survival，PFS)，并应用Log-rank方法进行统计学分析。　　7.应用Cox回归风险模型分析患者OS的独立危险因素，并建立列线图预后预测模型。　　研究结果：　　1.PGRN在食管癌细胞系中的表达及其与VEGF-C表达的相关性　　RT-PCR检测发现PGRN在食管癌细胞系TE-1，Eca109，K410，K450中均有表达;Western blotting检测发现，除K410外，其他食管癌细胞系中均有不同程度的PGRN表达。　　RT-PCR和Western blot检测证实，VEGF-C与PGRN在TE-1，Eca109，K450细胞中共表达。提示，在食管癌中PGRN和VEGF-C的表达存在相关性。　　2.上/下调TE-1细胞中PGRN的表达对VEGF-C表达的影响　　分别应用PGRN-vector和siRNA(PGRN sh1，PGRN-sh2和PGRN-sh3)上、下调TE-1细胞中PGRN表达，RT-PCR和Western blot检测发现VEGF-C的表达呈相同的变化趋势。　　3.TE-1细胞中PGRN对VEGF-C的表达调控可能通过p-ERK和p-AKT通路实现　　上调PGRN表达后，TE-1细胞中p-ERK，p-AKT和VEGF-C的表达上升，ERK，AKT，JNK，p-JNK的表达无明显变化。进一步研究发现，加入p-ERK抑制剂U0126可以阻断PGRN对p-ERK和VEGF-C的诱导效应;加入p-AKT抑制剂LY294002可以减弱PGRN对p-AKT和VEGF-C的诱导作用。因此，PGRN可能通过p-ERK和p-AKT信号通路调控食管癌细胞中VEGF-C的表达。　　4.PGRN在食管癌组织中的表达与患者淋巴结转移、LMVD及LVSI密切相关　　我们收集了96例食管癌患者的肿瘤标本和这些患者的临床病理资料。研究发现，PGRN高表达的患者比低表达患者淋巴结转移几率明显增高(69％VS46％，P=0.03)，但是PGRN的表达和患者年龄、性别、肿瘤直径、浸润深度、病理类型、肿瘤分级等临床病理参数无相关性。　　PGRN高表达的患者同时表达高水平的D2-40(LMVD的标志物)(P=0.016)，具有较高的LVSI阳性率(67％vs46％，P=0.04)。PGRN的表达与肿瘤组织LMVD(r=0.30，P=0.003)、LVSI(r=0.21，P=0.039)密切相关。　　5.PGRN在食管癌组织中的表达与VEGF-C、p-ERK及p-AKT密切相关　　高表达PGRN的患者也表达较高水平的VEGF-C(P＜0.001)，p-ERK(P＜0.001)，和p-AKT(P=0.035)，且PGRN的表达与VEGF-C(r=0.39，P=0.001)，p-ERK(r=0.33，P=0.001)和p-AKT(r=0.30，P-0.03)的表达正相关。因此，体内研究证实，PGRN可能通过p-ERK和p-AKT调控VEGF-C的表达，促进食管癌的淋巴管生成和淋巴结转移。　　6.PGRN在食管癌中的表达对患者生存的影响　　Kaplan-Meier曲线显示高表达PGRN的患者的OS及PFS较低表达者均显著缩短。Cox风险模型分析提示高PGRN表达的患者比低PGRN表达的患者死亡风险高1.99倍（95％的可信区间1.05～3.78，P=0.035）;疾病进展风险提高2.88倍（95％可信区间:1.55～5.35，P=0.001）。　　7.食管癌患者预后预测模型的建立　　Cox回归风险模型分析显示，TNM分期(hazard ratio:2.64，95％可信区问1.07～6.50;P=0.035)，淋巴结转移(hazard ratio:1.31，95％可信区间2.26～7.56;P＜0.001)，PGRN表达水平(hazard ratio:1.36，95％可信区间1.05～1.77;P=0.022)，ERK磷酸化程度(hazard ratio:1.42，95％可信区间1.07～1.89;P=0.016)是食管癌死亡的独立危险因素。基于这四项独立预后因素建立列线图模型，可用于食管癌患者的预后评估。　　研究结论：　　1.PGRN在食管癌高表达，与食管癌的淋巴管生成、淋巴结转移密切相关。　　2.PGRN可能通过p-AKT、p-ERK信号通路诱导VEGF-C的表达，发挥促进食管癌、淋巴管生成、淋巴结转移的作用。　　3.PGRN高表达与食管癌患者不良预后相关，是食管癌患者独立预后因素之一。　　4.基于TNM分期、淋巴结转移、PGRN表达、ERK磷酸化程度建立的列线图模型可以用于食管癌患者的预后评估。