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肺癌是发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤之一。在2018年全球约有210万人被诊断患有肺癌,并且有180万人因肺癌而死亡。随着世界范围内工业化和环境污染的加剧,肺癌的发病率逐年增加。肺癌的发生与环境密切相关,云南省宣威市和个旧市是我国肺癌高发地区之一,吸烟、使用烟煤和锡矿开采可能是这些地区肺癌高发的主要因素。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占所有肺癌的80%左右。肿瘤的转移和复发成为非小细胞肺癌治疗中的主要难题。目前大部分肺癌患者在确诊时病情已经发展至中晚期阶段,且患者整体预后较差。靶向治疗和免疫疗法已经成为未来肺癌治疗的主要方向。细胞内信号转导的异常可导致癌症等疾病的发生。因此,对肺癌细胞信号传导网络复杂性的进一步了解,发现新的诊断和治疗靶点已成为肺癌治疗中急需解决的问题。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路参与调控增殖,分化和存活等诸多细胞过程。该通路中核心成员的过度表达或异常激活是诊断癌症的常见指标,并且可促进肿瘤的发生和发展。Raf(rapidly accelerated fibrosarcoma)家族激酶A-Raf,B-Raf和C-Raf是MAPK通路中的关键蛋白,它们是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)和Ras(rat sarcoma)的下游信号分子。A-Raf的基础激酶活性远低于其他Raf激酶,它的表达分布也不如其他Raf激酶广泛。这导致对B-Raf和C-Raf的生物学功能研究较为透彻,而对A-Raf的研究具有局限性。因此对于A-Raf功能调控的全面解析就显得尤为重要。细胞内蛋白之间的相互作用是调控细胞过程的基础。目前对A-Raf的结合蛋白没有系统的鉴定和分析,这阻碍了对A-Raf激酶功能的进一步研究。因此在实验室前期对B-Raf和C-Raf结合蛋白分析的基础上,我们通过免疫共沉淀和质谱等蛋白质组学手段对静息状态下A-Raf的结合蛋白进行鉴定。我们研究发现:(1)鉴定得到132个A-Raf的结合蛋白,其中126个蛋白为首次发现。通过western blotting验证,这些蛋白有92%的阳性结合率;(2)分析表明A-Raf通过与结合蛋白的相互作用参与调控细胞凋亡,RNA分解代谢和细胞粘附;(3)A-Raf结合蛋白的功能完全覆盖肿瘤的十大特性,表明A-Raf在癌症的发生过程中具有调控作用。这些研究确定了A-Raf的潜在调节因子,并为其生物学功能的系统性了解提供了基础。为了进一步探究结合蛋白对三种Raf激酶功能差异的影响,我们对三种Raf激酶在血清饥饿和表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)刺激条件下的结合蛋白进行了系统比较。我们鉴定得到了近400个新的结合蛋白,其中有些蛋白与三个Raf激酶均相互作用,而有的蛋白仅与一种或两种Raf激酶结合。在血清饥饿条件下比较三种Raf激酶的结合蛋白发现了163个共同的蛋白,表明Raf激酶在无活性状态下具有相同的功能。相反,在EGF刺激的条件下仅鉴定得到87个共同的结合蛋白,表明Raf激酶被激活时通过特定的结合蛋白发挥不同的功能。部分A-Raf结合蛋白参与单一受精和精卵识别,提示A-Raf通过与其他蛋白相互作用在生殖过程中发挥作用。比较分析结合蛋白谱可以确定Raf激酶之间的差异,有利于发现新的功能和调节机制。酰基辅酶A结合结构域蛋白3(acyl-coenzyme A binding domain containing 3,ACBD3)作为一种多功能的高尔基体蛋白参与调控类固醇生成、病毒复制、细胞凋亡、亨廷顿舞蹈症等多种细胞功能和疾病。实验发现ACBD3与Raf激酶相互作用。我们选取在癌症中高表达的ACBD3作为研究对象,探究其在非小细胞肺癌发生中的作用机理。研究发现ACBD3在H1299细胞中可以促进细胞增殖、迁移、上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)等。体内裸鼠成瘤实验表明敲除ACBD3可以显著降低肿瘤形成的能力。ACBD3的表达量与细胞对顺铂(cisplatin,CDDP)和5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)的敏感性呈正相关。对细胞信号通路的研究发现,随着ACBD3表达量的增加,B-Raf激活性磷酸化位点S445的磷酸化程度增加,下游ERK的磷酸化程度也显著增加。总结,我们从互作蛋白质组水平探究了A-Raf结合蛋白的功能,成功鉴定得到126个新的A-Raf结合蛋白,全景解析了A-Raf的结合蛋白谱。比较不同培养条件下Raf家族激酶结合蛋白谱揭示了每个激酶功能的相似性和特异性。探究了Raf激酶结合蛋白ACBD3在肺癌发生中的作用,初步确定ACBD3可以促进肿瘤的发生,为肺癌的临床治疗提供了新的研究靶点。