研究背景: 卵巢早衰(prematureovarianfailurePOF)系指妇女在40岁以前绝经，常表现为雌激素水平降低引起的月经紊乱、不孕、围绝经期综合征等一系列症状。POF病因复杂，目前仍不清楚，化疗远期毒副作用是其中之一。随着化学毒性药物在肿瘤及自身免疫疾病的广泛应用，其导致的性腺功能损害成为研究新热点，其中以环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)为代表的烷化剂引起的卵巢功能损害研究较多，但其作用机制仍不清楚。一些研究显示，CTX可直接损伤卵巢颗粒细胞，并主要作用于有丝分裂活跃的卵泡，而静止的生殖细胞呈低度敏感。另有学者提出，化疗期间应用口服避孕药抑制卵泡发育，能够减少化疗对卵巢的损害，依据是化疗药物损伤卵巢的机制和口服避孕药的作用机理，即通过雌孕激素负反馈抑制下丘脑-垂体-卵巢轴，从而抑制卵泡发育，储存原始卵泡，保护卵巢储备功能，减少卵巢损伤。相关研究也证实口服避孕药能够降低及预防化疗对卵巢的损伤，促进化疗后卵巢功能甚至是生殖功能的恢复。但也有学者持不同观点，结论尚有争议。本研究旨在探讨化疗期间应用口服避孕药能否保护卵巢功能，以确定口服避孕药的有效性。 目的: 本文采用阴道涂片法监测大鼠动情周期，放射免疫法和组织切片法，检测大鼠血清雌二醇(E2)水平、卵泡刺激素(FSH)水平、卵巢重量及卵泡数量，并通过统计学分析，比较实验前后各组实验指标变化，探讨口服避孕药在化疗期间有否起到保护卵巢的作用及其相关机制。 材料与方法: 1.SPF级近交系雌性Wistar大白鼠，3月龄，体重180g～200g，购自中山大学实验动物中心。喂食SPF级鼠饲料及净化水，室温20℃～25℃，相对湿度45％～55％，每日光照12h，饲养1周熟悉环境后，每日清晨9:00行阴道细胞涂片，显微镜下观察动情周期，选用有正常动情周期的大鼠进入实验。口服避孕药(OC)--达英-35(35μg炔雌醇/2mg醋酸环丙孕酮)由先灵(广州)药业有限公司提供。环磷酰胺(CTX)，规格0.2g×10支，购自山西普德药业有限公司。 2.预实验，以确定最大程度抑制大鼠卵泡发育的最低OC剂量：12只雌性Wistar大鼠随机分为3组，灌胃给予不同剂量OC，第1组：4.375μg炔雌醇/0.25mg醋酸环丙孕酮；第2组：8.75μg炔雌醇/0.5mg醋酸环丙孕酮；第3组：17.50μg炔雌醇/1mg醋酸环丙孕酮。灌胃后每天行阴道涂片，并在第10天的动情间期测定各组E2、FSH浓度并进行比较。 3.动物实验：75只Wistar雌性大鼠随机分为5组：①空白对照组：不予任何药物处理；②CTX组：负荷剂量50mg/kg腹腔注射，之后8mg/(kg·d)腹腔注射，连续14d；③OC组：8.75gg炔雌醇/0.5mg醋酸环丙孕酮(溶于1ml生理盐水)，灌胃，连续25d；④联合治疗Ⅰ组：同时给予CTX和OC，连续15d，给药方法同②、③组；⑤联合治疗Ⅱ组：先连续10d给予OC灌胃，用药剂量同③组；第11d起加用CTX，给药方法、时间及剂量同④组。 4.采用阴道涂片法监测大鼠动情周期，放射免疫法测定E2、FSH浓度，试剂盒购自北京北方生物技术研究所。所有卵巢标本均经石蜡包埋，连续切片，苏木素-伊红(HE)染色。 从实验开始到结束，各组大鼠每天行阴道涂片，并于给药结束前，每隔5天(相当于大鼠1个正常动情周期)，于动情间期测定各组E2、FSH浓度：停药后第15、30天(相当于3及6个正常动情周期)，测定各组E2、FSH浓度。另外，停药当天、第15、30天，分别处死各组1/3大鼠，比较卵巢重量、卵泡数量变化。 5.统计学处理采用SPSS10.0软件包检验分析，数据以均数±标准差(x±s)表示，采用的具体统计学方法有单向方差分析、重复测量、析因分析，两两比较采用SNK及LSD法，所有结果均以P<0.05具有统计学意义。 结果: 1.预实验各组大鼠E2、FSH浓度及动情周期变化第1组给药后，动情周期持续存在，E2、FSH浓度高于第2、3组，差异有统计学意义(P<0.05)。第2、3组给药7～9天后均出现持续不排卵，且两组间E2及FSH分别比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，提示将OC剂量从8.75μg/0.5mg增加到17.5μg/1mg，不能增加抑制大鼠卵泡发育及排卵的程度，故认为8.75μg炔雌醇/0.5mg醋酸环丙孕酮这组剂量是可以抑制大鼠卵泡发育的最低有效剂量。 2.各组大鼠E2、FSH浓度及动情周期变化 (1)大鼠E2、FSH行重复测量分析，结果示各组、各时间点E2、FSH分别比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，且实验分组和时间均有交互作用(P<0.05)。 (2)空白对照组：于动情间期测定E2(52.22±2.92)pg/ml，FSH(3.71±0.21)mIU/ml。阴道涂片呈正常大鼠动情周期改变。 (3)CTX组：从给药第5天至实验结束，E2持续下降，FSH持续上升，与同期其余4组E2、FSH分别比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。阴道涂片见该组大鼠在给药3～5天后出现持续不排卵，至实验结束，动情周期仍未恢复。 (4)OC组：从给药第5天至停药第15天，该组E2、FSH浓度均低于同期空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。停药第30天，E2、FSH浓度分别与空白对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。阴道涂片见该组大鼠在给药7～9天后出现持续不排卵，停药20天左右恢复正常动情周期。 (5)联合治疗Ⅰ组：在联合给药第5天，E2高于CTX组，低于其余3组，而FSH低于CTX组及空白对照组，高于其余2组，差异均有统计学意义(P<0.05)。联合给药第10天、停药当天、15天，E2均高于同期CTX组，低于空白对照组，FSH低于CTX组和空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；与同期其余2组E2、FSH相比，均无差异(P>0.05)。停药第30天，E2高于CTX组，FSH低于CTX组，差异均有统计学意义(P<0.05)，与其余3组分别比较，均无差异(P>0.05)。阴道涂片见该组大鼠于给药4～5天后出现持续不排卵，停药20天左右恢复正常大鼠动情周期。 (6)联合治疗Ⅱ组：先给予OC药物的前10天，E2、FSH与同期OC组相比，均无差异(P>0.05)。之后，在联合给药第5天，E2高于CTX组及联合治疗Ⅰ组，低于空白对照组，同期FSH低于CTX组、空白对照组及联合治疗Ⅰ组，差异均有统计学意义(P<0.05)；而E2、FSH分别与OC组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。联合用药第10天、停药当天、15天，E2均高于CTX组，低于空白对照组，同期FSH均低于空白对照组及CTX组，差异均有统计学意义(P<0.05)，而E2、FSH分别与其他2组比较，均无差异(P>0.05)。停药第30天，E2明显高于CTX组，FSH明显低于CTX组，差异均有统计学意义(P<0.05)，与其余3组分别比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。阴道涂片见该组大鼠在给药7～9天后出现持续不排卵，停药20天左右恢复正常动情周期。 (7)比较联合治疗I、Ⅱ组的E2浓度，在联合给药第5天，前者低于后者，差异有统计学意义。之后2组每次测定的E2比较，联合治疗Ⅱ组均高于Ⅰ组，但差异均无统计学意义(P>0.05)。 3.各组大鼠卵巢重量的变化 (1)大鼠卵巢重量行析因分析，结果示各组、各时间点卵巢重量，差异均有统计学意义(F=137.561，P=0.000；F=39.511，P=0.000)，且实验分组和时间有交互作用(F=14.188，P=0.000)。 (2)空白对照组大鼠卵巢重量为(68.73±3.97)mg。 (3)OC组和联合治疗I、Ⅱ组，在停药当天，大鼠卵巢重量降低，分别与空白对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；而3组之间相互比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。之后3组卵巢重量均持续增长，至停药第30天，3组基本恢复正常大鼠卵巢重量水平，与同期空白对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。同期分别比较联合治疗I、Ⅱ组的卵巢重量，Ⅱ组均高于Ⅰ组，但差异无统计学意义(P>0.05)(4)CTX组按时间依次测定的卵巢重量，一直呈持续性下降，分别与同期其余各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。 4.各组大鼠卵泡数量的变化 结论: 1.环磷酰胺损伤大鼠各期卵泡，尤其是成熟卵泡，并且对卵泡生长有刺激作用，加速原始卵泡发育为成熟卵泡，最终导致各级卵泡耗竭。 2.口服避孕药通过雌孕激素负反馈作用，抑制了大鼠卵泡发育和生长，储存了大量原始卵泡，有效保护了卵巢储备功能。 3.联合治疗组中口服避孕药的应用，减少了卵泡对环磷酰胺的敏感性，降低了化疗对卵巢的损伤，对卵巢功能的保护和恢复起到了一定的作用。 4.由于实验条件有限，未能在停药后进行交配，故大鼠的生育功能是否恢复，有待以后进一步实验证明。