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前列腺癌(prostate cancer)是老年男性常见的恶性肿瘤疾病之一。在全球前列腺癌发病率位于所有男性恶性肿瘤第二位,占所有恶性肿瘤第五位。2016年,前列腺癌全球患者数目达到140万,是危害全球男性健康的主要肿瘤之一。在我国,由于生活方式的改变以及老龄化进程加剧,我国前列腺癌疾病发病率逐年增加,而且我国新发前列腺癌患者就诊时多为局部晚期或广泛转移患者。对于这些晚期前列腺癌患者雄激素阻断治疗(androgen deprivation therapy,ADT)已经成为标准治疗方法。ADT治疗使用的药物包括黄体生成素释放激素(luteinizing hormone releasing hormone,LHRH)激动剂和雄激素受体(androgen receptor,AR)拮抗剂。患者经过ADT治疗病情能够缓解,之后前列腺癌细胞往往对ADT治疗反应逐渐减弱,最终转变为去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer,CRPC)。目前,放疗或药物治疗CRPC效果不佳,而且特异性不强,因此探索能够选择性诱导CRPC细胞死亡的药物对于前列腺癌治疗有着深远影响。细胞死亡方式多种多样,主要包括凋亡、自噬和坏死。目前,抗肿瘤药物的研究多集中在凋亡领域,但是几乎所有的肿瘤细胞均会出现凋亡抵抗,从而限制了该类药物的应用。因此,探索非凋亡的细胞死亡方式逐渐成为提高抗肿瘤治疗疗效的研究热点。2012年Dixon等在研究纤维肉瘤的抗肿瘤药物时,发现化合物erastin能诱导肿瘤细胞产生一种以线粒体皱缩、双层膜密度增加为形态学特征,以铁依赖的脂质过氧化反应为代谢特征,且受胱氨酸转运通路调节的细胞死亡方式,并将其命名为铁死亡(ferroptosis)。由于肿瘤细胞抗氧化系统活性较高,所以肿瘤细胞能够对氧化应激有较强的耐受能力。Nrf2是调控细胞氧化应激的核心转录因子。它能够发挥强大的抗氧化/抗凋亡作用,是肿瘤细胞耐药性的重要机制。当细胞或机体暴露于活性氧(reactive oxygen species,ROS)时,ROS可引起细胞骨架相关性抑制蛋白Keap1的修饰(如磷酸化),从而使Keap1-Nrf2复合体解离,从而使Nrf2由胞质内的转位到胞核,与受其调控的抗氧化酶基因的抗氧化反应元件结合,从而使抗氧化蛋白水平增加,促进细胞存活。血红素氧合酶1(hemo oxygenase 1,HO-1),γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)和醌氧化还原酶1(NQO1)是Nrf2调控氧化应激的主要酶类靶蛋白。为进一步探索Nrf2/HO-1信号通路调控CRPC细胞铁死亡机制,本研究拟应用erastin诱导CRPC细胞铁死亡模型,利用基因沉默技术调控Nrf2/HO-1表达水平,揭示Nrf2/HO-1在CRPC细胞铁死亡中的调控作用。第一部分Erastin诱导去势抵抗性前列腺癌细胞发生铁死亡目的:利用MTT、电镜以及Western blot等技术方法来研究erastin能否诱导CRPC细胞发生铁死亡。方法:基于erastin诱导CRPC细胞(PC3、DU145细胞系)铁死亡模型,利用MTT、电镜以及Western blot等技术方法探究其是否发生铁死亡。结果:(1)通过MTT检测,CRPC细胞活力随着erastin浓度增加而下降,并且能够被特异性铁死亡抑制剂(Fer-1、DFO、NAC)逆转。(2)观察经erastin处理的CRPC细胞形态学改变,发现铁死亡细胞发生细胞变小变圆且相互之间分离,线粒体、内质网膜损伤、线粒体嵴破坏、细胞器肿胀改变。(3)Western blot检测并未发现经erastin处理的CRPC细胞内caspase3、LC3蛋白水平改变。结论:Erastin诱导CRPC细胞发生铁死亡,该过程能够被特异性铁死亡抑制剂逆转;这种细胞死亡方式是一种新的不同于凋亡、自噬等的死亡方式;铁死亡以线粒体及内质网膜破坏,细胞器肿胀变性为形态学特征。第二部分去势抵抗性前列腺癌细胞铁死亡过程中过氧化以及Nrf2/HO-1蛋白水平改变目的:利用MDA试剂盒检测、流式细胞术以及Western blot等技术方法来研究CRPC细胞铁死亡过程中过氧化水平,以及Nrf2/HO-1蛋白水平改变。方法:用化合物erastin处理CRPC细胞(PC3、DU145细胞系),利用MDA试剂盒检测、流式细胞术以及Western blot等技术方法研究CRPC细胞铁死亡过程中细胞内过氧化水平以及Nrf2/HO-1蛋白水平改变。结果:相比对照组(1)通过流式细胞术检测细胞ROS水平,发现实验组ROS水平增加。(2)通过MDA试剂盒检测,发现实验组脂质过氧化水平升高。(3)Western blot检测发现经erastin处理的CRPC细胞内Nrf2、HO-1蛋白水平增加、Keap1蛋白水平下降。结论:Erastin诱导CRPC细胞发生铁死亡,细胞内Nrf2、HO-1蛋白表达增加,Keap1蛋白表达降低;CRPC细胞铁死亡过程中细胞内ROS水平增加,脂质过氧化水平升高。第三部分沉默Nrf2/HO-1对去势抵抗性前列腺癌细胞铁死亡影响研究目的:利用基因沉默技术、MTT、MDA试剂盒检测、流式细胞术以及Western blot等技术方法来研究沉默Nrf2/HO-1对CRPC细胞铁死亡影响。方法:沉默Nrf2/HO-1,利用MTT、MDA试剂盒检测、流式细胞术以及Western blot等技术方法研究Nrf2/HO-1沉默的CRPC细胞铁死亡过程中细胞内过氧化水平,以及Nrf2/HO-1蛋白水平改变。结果:(1)流式细胞术检测细胞ROS水平,发现Nrf2/HO-1沉默的CRPC细胞ROS水平增加。(2)MDA试剂盒检测,发现Nrf2/HO-1沉默的CRPC细胞脂质过氧化水平升高。(3)Western blot检测发现Nrf2/HO-1沉默的CRPC细胞铁死亡过程中细胞内Nrf2、HO-1蛋白水平降低。(4)沉默Nrf2基因,HO-1诱导剂Co PP(钴原卟啉)能够逆转铁死亡过程。结论:沉默Nrf2/HO-1基因,增加CRPC细胞对erastin敏感性,使CRPC细胞铁死亡过程中细胞内ROS水平、脂质过氧化水平进一步升高;另外,erastin诱导CRPC细胞铁死亡过程能够被HO-1诱导剂Co PP逆转。