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结直肠癌是全球发病率及死亡率较高的的恶性肿瘤之一。本实验室前期在国家自然科学基金面上项目和云南省科技攻关项目的支持下,构建了抗p21Ras细胞内抗体,旨在阻断Ras信号传导通路,从而达到靶向治疗Ras基因高表达的肿瘤的目的。但表达后的单链抗体蛋白由于分子量较大,不能穿透细胞膜,急需一种方式去携带单链抗体去穿透细胞膜。RGD短肽有着携带大分子蛋白穿透肿瘤细胞膜的作用,因此本实验选用RGD肽作为引导肽携带抗p21Ras单链抗体穿透肿瘤细胞膜来检测RGD单链抗体融合蛋白的穿膜机制及体外抗肿瘤活性。实验目的:1.表达出RGD-抗p21Ras单链抗体融合蛋白及RGD-EGFP绿色荧光融合蛋白;2.通过绿色荧光蛋白标记RGD肽,来检测RGD肽的穿膜机制;3.通过体外实验,研究RGD-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对人结直肠癌细胞SW480的影响。最终实现RGD肽携带抗p21ras单链抗体穿透细胞膜抑制人结直肠癌细胞SW480及阐释RGD肽的穿膜机制,为结直肠癌的靶向治疗提供新方法。实验方法:1.RGD-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的原核表达,纯化及鉴定:原核蛋白表达RGD-抗p21Ras单链抗体融合蛋白并纯化,Western Blot及ELISA实验检测RGD-抗p21Ras单链抗体融合蛋白与抗原Ras的免疫反应,并在RGD肽与单链抗体之间引入蛋白连接肽linker,来检测linker的加入对于免疫反应的影响。2.穿膜实验:（1）通过免疫组化及免疫荧光实验检测RGD-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的穿膜能力。（2）通过绿色荧光蛋白EGFP标记RGD肽,来检测RGD肽的时间、浓度的依赖性,检测RGD肽的肿瘤靶向性能力,检测低温对RGD肽穿膜的影响,检测胞吞抑制剂对RGD肽穿膜能力的影响,检测膜外电势差改变对RGD肽穿膜效果的影响。3.体外实验:检测RGD-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对肿瘤细胞SW480的影响:通过MTT实验、平板克隆、细胞划痕实验以及TUNEL凋亡检测等方法分别检测RGD-抗p21Ras单链抗体融合蛋白后的肿瘤细胞杀伤、增殖、迁移及凋亡的变化情况进行检测。实验结果:ELISA与Western Blot实验检测RGD-抗p21Ras单链抗体融合蛋白可以与抗原Ras发生免疫反应,此外RGD肽与单链抗体之间linker的连接与否并不影响融合蛋白的免疫反应。免疫组化及免疫荧光实验检测了RGD-抗p21Ras单链抗体融合的穿膜能力,通过EGFP绿色荧光蛋白的标记,验证了RGD肽的肿瘤靶向性,RGD肽融合蛋白具有时间浓度依赖性,低温会影响RGD肽融合蛋白的穿膜效果,是由于4℃的温度影响了RGD肽的内吞作用,从而验证了RGD肽是一种内吞作用机制。另外,各种胞吞抑制剂的加入也影响了RGD肽融合蛋白的穿膜效果,可以说明RGD肽融合蛋白是一个内吞形式的穿膜机制。体外实验结果中,划痕实验显示RGD-抗p21Ras单链抗体融合蛋白可有效抑制SW480细胞的迁移能力。平板克隆实验表明RGD-抗p21Ras单链抗体融合蛋白可以抑制肿瘤细胞SW480的增殖能力。MTT实验表明RGD-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对SW480细胞具有一定的杀伤能力。TUNEL凋亡检测实验结果显示RGD-抗p21Ras单链抗体融合蛋白可以明显促进结直肠癌SW480细胞的凋亡。实验结论:1.通过镍离子纯化柱纯化融合蛋白,BCA法检测融合蛋白的浓度,密码子优化后的融合蛋白浓度要高于未优化的;2.通过ELISA及免疫组化实验,验证了RGD-抗p21Ras单链抗体与Ras之间的免疫反应,RGD肽与单链抗体蛋白之间连接肽linker的连接,并不影响抗原Ras与RGD-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的免疫反应;3.通过绿色荧光蛋白示踪标记RGD肽,证实了RGD肽的靶向性,RGD肽浓度时间的依赖性,而低温及胞吞抑制剂的加入,证实了RGD肽是一种非能量依赖性的胞吞形式的穿膜机制;4.通过MTT、平板克隆、细胞划痕和TUNEL凋亡等体外实验,证实了RGD-抗p21Ras单链抗体融合蛋白可有效抑制肿瘤细胞SW480的生长、增殖、迁移及促进肿瘤细胞凋亡;本次研究通过RGD肽携带单链抗体的肿瘤治疗策略,为结直肠癌的治疗提供新方法。