【摘 要】
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目的:DNA聚合酶γ（DNApolymeraseγ,PolG）是一种线粒体DNA聚合酶,对维持线粒体功能的稳定及线粒体DNA（Mitochondria deoxyribonucleic acid,mt DNA）的完整起到关键作用。PolG基因突变可以导致线粒体基因组的不稳定,从而使线粒体功能异常,PolG缺失小鼠则表现出年龄依赖性的DNA突变累积及早衰现象,且随着年龄的增加,其皮下脂肪减少并伴有骨
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目的:DNA聚合酶γ（DNApolymeraseγ,PolG）是一种线粒体DNA聚合酶,对维持线粒体功能的稳定及线粒体DNA（Mitochondria deoxyribonucleic acid,mt DNA）的完整起到关键作用。PolG基因突变可以导致线粒体基因组的不稳定,从而使线粒体功能异常,PolG缺失小鼠则表现出年龄依赖性的DNA突变累积及早衰现象,且随着年龄的增加,其皮下脂肪减少并伴有骨质疏松。脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）具有分化为成骨细胞,脂肪细胞和软骨细胞等多种细胞的能力。ADSCs在分化过程中的代谢方式会从以糖酵解为主转化为以有氧氧化为主,在这一过程中会伴随mt DNA的合成及线粒体功能的增强。本课题提取PolG缺失小鼠与野生型（Wild Type,WT）小鼠的ADSCs,并进行诱导分化,对比其分化能力,进而探究PolG基因突变影响下的线粒体DNA受损与功能障碍是否影响ADSCs的分化潜能。研究方法:1、饲养培育PolG杂合子小鼠(PolG+/-),杂交得到PolG敲除（Conventional Knockout,KO）小鼠(PolG-/-)与WT小鼠(PolG+/+)。2、选取同窝PolG-KO小鼠与WT小鼠,进行小鼠ADSCs的提取、培养及鉴定。3、对第三代WT ADSCs与PolG-KO ADSCs进行成骨诱导,采用荧光实时定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction,q PCR）,茜素红染色,蛋白免疫印迹（Western blotting,WB）检测成骨分化能力,以检验WT ADSCs与PolG-KO ADSCs的成骨分化能力是否有差异。4、对两种ADSCs进行成脂诱导,采用油红O染色及WB检测其成脂分化能力,以检验PolG-KO ADSCs与WT ADSCs的成脂分化能力是否有差异。5、将第三代WT ADSCs（WT-P3）、复制性衰老的第六代WT ADSCs（WT-P6）与第三代PolG-KO ADSCs（KO-P3）进行细胞衰老β-半乳糖苷酶（senescence-associatedβ-Gal,SA-β-Gal）染色,WB实验检测P53蛋白,成脂、成骨诱导分化实验检测PolG-KO ADSCs与自然衰老ADSCs的分化潜能是否有差异。6、对WT ADSCs与PolG-KO ADSCs细胞培养基及成脂诱导分化后的细胞培养基进行乳酸含量测定,通过q PCR检测在分化过程中PolG蛋白的表达变化。WB检测氧化呼吸相关蛋白乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）及锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase,Mn SOD）验证PolG在ADSCs分化过程中所起作用。结果:1、诱导分化后茜素红染色,成骨相关蛋白表达结果证明PolG基因缺陷会导致ADSCs成骨分化能力降低。2、油红O染色、成脂相关蛋白表达结果检测证明PolG基因缺陷会导致ADSCs成脂分化能力降低。3、SA-β-Gal染色结果及P53蛋白表达水平上升表明PolG基因缺陷会导致ADSCs衰老,成骨诱导分化结果表明Polg-KO ADSCs与复制性衰老的ADSCs有着相似的成骨分化能力降低的结果,但成脂诱导分化结果表明PolG-KO ADSCs成脂分化能力降低,而衰老的ADSCs成脂分化能力与正常ADSCs无明显差别。4、培养基乳酸含量测定及氧化磷酸化相关蛋白水平检测结果可推测PolG基因缺陷会导致ADSCs分化过程中氧化磷酸化降低糖酵解增强,因此推测其代谢方式的转化受到抑制。实验结论:PolG基因缺陷会导致ADSCs多向分化能力降低,其原因是由于PolG基因缺陷加速ADSCs衰老以及在其分化过程中代谢方式的转化受到抑制。
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