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动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种慢性炎症性疾病,其主要特征是大动脉中脂质和纤维素的沉积、单核-巨噬细胞浸润及斑块形成,机制复杂,是心脏病和中风的主要病因.巨噬细胞源性泡沫细胞是动脉斑块的主要组成部分之一.氧化铜纳米颗粒(Copper oxide nanoparticles, CuONPs)是目前广泛应用的金属纳米材料之一,大量研究证明其对机体是有害的,但 CuONPs 对动脉粥样硬化的影响目前还未见报道.氧化低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)广泛用于泡沫细胞模型的建立,为了探讨 CuONPs 在动脉粥样硬化中调控的分子机制,本课题在体外进行细胞实验,研究CuONPs对ox-LDL诱导的泡沫细胞形成的影响,从而揭示 CuONPs 在动脉粥样硬化的发生发展中所起的作用,进一步为动脉粥样硬化的防治及治疗提供新思路.
实验目的:
以Raw264.7巨噬细胞为对象,研究CuONPs对ox-LDL诱导的泡沫细胞形成的影响,并探讨自噬在其中所起的作用,以及p38和ERK MAPK信号通路在调控自噬中的作用.
实验方法:
1. CCK8试剂盒检测CuONPs对细胞活力的影响;油红O染色实验分析CuONPs对泡沫细胞形成的影响,以ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞建立泡沫细胞模型.
2.Western blot和激光共聚焦显微镜观察CuONPs对细胞自噬小体形成的影响;NH4Cl和BafA1干预细胞,Western blot和激光共聚焦显微镜检测细胞自噬流的变化情况;透射电子显微镜( Transmission electron microscopy,TEM),Western blotting及流式细胞术(Flow cytometer,FCM)研究细胞的溶酶体功能.
3.Western blotting检测细胞中p-p38和p-ERK蛋白水平的表达情况,以探讨此信号通路在自噬的活化过程中所起的作用.
实验结果:
1.CuONPs可显著抑制Raw 264.7细胞活力,并呈一定的剂量依赖关系;50μg/ml ox-LDL或(和)10μg/ml的CuONPs处理细胞24h,能明显促进ox-LDL诱导的巨噬源性泡沫细胞形成.
2. CuONPs通过损伤溶酶体功能阻断自噬流:(1)CuONPs显著上调细胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ和P62蛋白的表达水平,并增加GFP-LC3融合蛋白的荧光斑点的数量,说明CuONPs促进了Raw264.7巨噬细胞中自噬小体形成;(2)NH4Cl和BafA1预处理细胞后,western blotting结果证明CuONPs 可能阻碍自噬小体的降解;此外,mRFP-GFP-LC3 融合质粒瞬时转染细胞,结果证明 CuONPs 阻断了自噬体的降解过程,最终导致自噬体累积;(3)最后,TEM观察到CuONPs沉积于溶酶体中,溶酶体肿胀,western blotting显示溶酶体膜蛋白LAMP1/2异常上调,流式细胞术显示Lysosensor和Lyso-Tracker荧光异常增强.
3. CuONPs能显著上调细胞的p38和ERK的磷酸化水平.
结论: CuONPs暴露能促进ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫细胞形成.其机制是 CuONPs 能通过阻断自噬小体的降解,促进了自噬体的累积.溶酶体的损伤是自噬体降解被阻断的主要原因.因此,损伤的溶酶体不能对脂质进行降解,导致脂质排出受阻,过多的脂质累积于细胞中,形成动脉粥样硬化斑块中的泡沫细胞.此外,p38 和 ERK MAPK通路可能是CuONPs调控自噬的主要两条信号通路.
实验目的:
以Raw264.7巨噬细胞为对象,研究CuONPs对ox-LDL诱导的泡沫细胞形成的影响,并探讨自噬在其中所起的作用,以及p38和ERK MAPK信号通路在调控自噬中的作用.
实验方法:
1. CCK8试剂盒检测CuONPs对细胞活力的影响;油红O染色实验分析CuONPs对泡沫细胞形成的影响,以ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞建立泡沫细胞模型.
2.Western blot和激光共聚焦显微镜观察CuONPs对细胞自噬小体形成的影响;NH4Cl和BafA1干预细胞,Western blot和激光共聚焦显微镜检测细胞自噬流的变化情况;透射电子显微镜( Transmission electron microscopy,TEM),Western blotting及流式细胞术(Flow cytometer,FCM)研究细胞的溶酶体功能.
3.Western blotting检测细胞中p-p38和p-ERK蛋白水平的表达情况,以探讨此信号通路在自噬的活化过程中所起的作用.
实验结果:
1.CuONPs可显著抑制Raw 264.7细胞活力,并呈一定的剂量依赖关系;50μg/ml ox-LDL或(和)10μg/ml的CuONPs处理细胞24h,能明显促进ox-LDL诱导的巨噬源性泡沫细胞形成.
2. CuONPs通过损伤溶酶体功能阻断自噬流:(1)CuONPs显著上调细胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ和P62蛋白的表达水平,并增加GFP-LC3融合蛋白的荧光斑点的数量,说明CuONPs促进了Raw264.7巨噬细胞中自噬小体形成;(2)NH4Cl和BafA1预处理细胞后,western blotting结果证明CuONPs 可能阻碍自噬小体的降解;此外,mRFP-GFP-LC3 融合质粒瞬时转染细胞,结果证明 CuONPs 阻断了自噬体的降解过程,最终导致自噬体累积;(3)最后,TEM观察到CuONPs沉积于溶酶体中,溶酶体肿胀,western blotting显示溶酶体膜蛋白LAMP1/2异常上调,流式细胞术显示Lysosensor和Lyso-Tracker荧光异常增强.
3. CuONPs能显著上调细胞的p38和ERK的磷酸化水平.
结论: CuONPs暴露能促进ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫细胞形成.其机制是 CuONPs 能通过阻断自噬小体的降解,促进了自噬体的累积.溶酶体的损伤是自噬体降解被阻断的主要原因.因此,损伤的溶酶体不能对脂质进行降解,导致脂质排出受阻,过多的脂质累积于细胞中,形成动脉粥样硬化斑块中的泡沫细胞.此外,p38 和 ERK MAPK通路可能是CuONPs调控自噬的主要两条信号通路.