粗毛纤孔菌发酵、三萜的提取与分离纯化研究

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粗毛纤孔菌属于担子菌门十分珍贵的一种药用真菌,由于其含有许多生物活性物质,在民间常用此菌治疗胃病、风湿、糖尿病及癌症等各种疾病。本研究以粗毛纤孔菌为原材料,对其产三萜类化合物的发酵条件进行优化;并且通过响应面优化法对三萜类物质的提取工艺进行研究,提高三萜提取率;最后通过大孔树脂吸附法对其分离纯化工艺进行分析,研究的主要结论如下:1.以粗毛纤孔菌深层发酵菌丝体的总三萜产量为目标,通过单因素和正交实验对粗毛纤孔菌的液体发酵培养基进行优化,确定最佳的液体发酵培养基为:40g/L葡萄糖,5g/L黄豆粉,1.5g/L硫酸镁,3g/L磷酸二氢钾和0.05g/L维生素B1。后期对摇瓶发酵条件进行优化,结果表明:在接种量为3片(φ12mm)菌丝片,pH为6,装液量为100mL/250mL的三角瓶,转速为155r/min,27℃条件下培养11d,粗毛纤孔菌发酵菌丝生物量可达2.20g/1OOmL,胞内总三萜产量可达100.83mg/100mL。2.为提高粗毛纤孔菌三萜物质的提取率,利用响应面法对粗毛纤孔菌三萜类化合物的水提取及超声波工艺进行优化。水提取工艺中,在单因素的基础之上选择溶剂体积分数、提取温度、料液比、提取时间为自变量,三萜提取得率为响应值,通过响应面分析法,研究各自变量的交互作用对三萜提取率的影响,并模拟得到二次多项式回归方程的预测模型,从而预测最佳的提取工艺为:乙醇体积分数73%、提取温度67℃、料液比(g/mL)1:53.0、提取时间5.25h,三萜的提取得率为4.59%。超声波提取工艺中,在单因素的基础之上,选择溶剂体积分数、料液比、超声时间、超声功率为自变量,三萜提取得率为响应值从而预测最佳的提取工艺为:在提取温度为50℃条件下,乙醇体积分数72%、料液比(g/mL)1:69、超声时间31min、超声功率为210w,三萜提取得率达5.61%。试验研究了室温浸提及摇床振荡提取法,其三萜提取率分别为3.51%和4.23%,通过比较发现超声波提取方法最佳,不仅节约时间而且简便易操作具有一定实际生产意义。3.为提高粗毛纤孔菌三萜化合物的纯度,本研究采用大孔树脂吸附法对其粗提液进行分离纯化,通过静态吸附试验对7种不同类型的树脂进行筛选,结果表明:非极性D101型树脂的吸附纯化性能最好,吸附率为46.9%,解析率为89.71%,回收率可达42.07%。通过动态吸附与解析试验表明D101型树脂分离纯化的最佳工艺条件为:上样液的浓度为0.232mg/mL, pH7,,以0.25mL/min的流速上柱,4BV的蒸馏水冲洗后用2BV80%的乙醇溶液进行洗脱,洗脱流速为1mL/min。经D101型树脂分离纯化后,三萜化合物的回收率达74.92%,纯度从5.05%提高到27.82%。利用该工艺条件能够较好的分离纯化三萜类物质,对工业化生产具有一定的生产实践意义。
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