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背景目的：
结直肠癌(Colorectalcancer,CRC)是人类高发恶性肿瘤，其发病率在全球范围内持上升态势，发病率升至第三位，死亡率排至第二位。在中国，结直肠癌死亡率在恶性肿瘤死亡率中排名第五，严重危害人类健康。结肠癌是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，当今治疗的主要手段有手术切除，放疗和化疗，但由于其复杂的发病机制，高发生率、高致死率、低治愈率以及预后性差的特点使得这些治疗手段达不到预期治疗效果，因此需要不断寻找新的治疗策略来提高结肠癌病人的生存率，同时探讨结肠癌发生发展的新机制，为结肠癌治疗提供新的药物治疗靶点，从而开发新的安全有效的抗癌药物。
奥沙利铂是第三代铂类抗癌药物，具有强大的抗肿瘤作用。它已广泛用于治疗各种肿瘤，但大剂量的奥沙利铂可引起强烈的副作用，如胃肠道反应、骨髓抑制神经末梢炎症，而小剂量奥沙利铂可引起耐药性。本文考察的是，发现一种天然无毒的提取于可食用性植物根茎的一种天然的倍半萜内酯，土木香内酯，与奥沙利铂合用并降低其明显的毒副作用，协同抑制结肠癌细胞增殖。从机制分析显示，土木香内酯增敏奥沙利铂诱导结肠癌细胞凋亡可能是通过激活ROS介导的JNK和p38MAPK信号通路作用的，且提示联合药物递送方法有望成为未来结肠癌的有效治疗手段。
实验方法：
1.土木香内酯联合奥沙利铂的体外抗结肠癌活性研究
采用MTT法检测单独或组合的土木香内酯和奥沙利铂对结肠癌细胞HCT-116和RKO增殖作用的影响。采用流式细胞仪、DAPI染色和荧光显微镜拍照技术检测联合给药对细胞内活性氧(ROS)水平的影响。采用流式细胞仪和WesternBlot检测联合给药对细胞凋亡的影响。通过FCM检测法、DAPI染色和荧光显微镜拍照检测联合给药加入NAC(ROS抑制剂)后诱导HCT116和RKO细胞的ROS产生以及凋亡情况。通过WesternBlot检测HCT116、RKO细胞在单独或者联合作用下p-JNK、p-p38蛋白的表达情况。将HCT116和RKO细胞与JNK抑制剂和p38抑制剂预孵育后，通过WesternBlot检测HCT116和RKO细胞中p-JNK和p-p38蛋白的表达。
2.土木香内酯联合奥沙利铂的体内抗结肠癌活性研究
将人HCT116结肠癌细胞悬浮液接种于BALB/c（nu/nu）雌性裸鼠背部皮下建立移植瘤模型。接种结肠癌细胞后，当裸鼠右侧腹股沟肿瘤体积达到约100-200mm3时，将裸鼠随机分为4组。对照组，土木香内酯组，奥沙利铂组，土木香内酯联合奥沙利铂给药组。每组5只小鼠，每隔一天腹腔注射给药，并通过用游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度，以及记录老鼠体重。采用免疫组化检测联合给药后对裸鼠皮下异位移植瘤的抗肿瘤活性的影响。通过WesternBlot验证在细胞水平上土木香内酯和奥沙利铂联合给药的抗肿瘤分子机制，取出肿瘤组织检测JNK和p38MAPK信号通路相关蛋白表达。
实验结果：
1.MTT结果表明联合给药对HCT116和RKO两种结肠癌的增殖抑制作用比单独给药时效果更好。
2.流式细胞仪凋亡检测结果显示联合给药诱导两种结肠癌细胞的凋亡优于单次给药。实验表明，共同给药的组合抗肿瘤作用是通过促进肿瘤细胞的凋亡来进行的。
3.流式细胞仪ROS检测结果显示，与阴性对照组DMSO及单独给药相比，联合给药刺激ROS的产生比单独给药强，当提前孵育NAC2小时后，联合给药作用刺激ROS产生的作用以及促凋亡的作用被抑制。
4.细胞免疫荧光显示，联合给药诱导两种结肠癌细胞的凋亡比单独给药作用效果好，当提前孵育NAC2小时后，联合作用效果被抑制。
5.WesternBlot结果显示，联合给予两种结肠癌细胞p-JNK，p-p38蛋白表达水平强于单剂量刺激，当用JNK、p38和ROS抑制剂提前孵育后，所述蛋白水平效果被抑制。
6.体内抗肿瘤实验显示，与阴性及单药组相比，联合给药组的肿瘤体积明显较小。此外，联合给药对裸鼠本身毒性相对较低。对各组肿瘤组织进行WesternBlot检测得出，联合给药组JNK、p38蛋白的表达较单药组明显增高。
实验结论：土木香内酯通过上调ROS激活MAPK通路来增敏奥沙利铂从而诱导结肠癌细胞凋亡，我们发现该联合给药方案具有很好的抗结肠癌作用。所有的这些实验研究结果都足以证明我们实验设计的准确性，也为今后提供了一个较好的抗肿瘤治疗候选组合药物。
结直肠癌(Colorectalcancer,CRC)是人类高发恶性肿瘤，其发病率在全球范围内持上升态势，发病率升至第三位，死亡率排至第二位。在中国，结直肠癌死亡率在恶性肿瘤死亡率中排名第五，严重危害人类健康。结肠癌是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，当今治疗的主要手段有手术切除，放疗和化疗，但由于其复杂的发病机制，高发生率、高致死率、低治愈率以及预后性差的特点使得这些治疗手段达不到预期治疗效果，因此需要不断寻找新的治疗策略来提高结肠癌病人的生存率，同时探讨结肠癌发生发展的新机制，为结肠癌治疗提供新的药物治疗靶点，从而开发新的安全有效的抗癌药物。
奥沙利铂是第三代铂类抗癌药物，具有强大的抗肿瘤作用。它已广泛用于治疗各种肿瘤，但大剂量的奥沙利铂可引起强烈的副作用，如胃肠道反应、骨髓抑制神经末梢炎症，而小剂量奥沙利铂可引起耐药性。本文考察的是，发现一种天然无毒的提取于可食用性植物根茎的一种天然的倍半萜内酯，土木香内酯，与奥沙利铂合用并降低其明显的毒副作用，协同抑制结肠癌细胞增殖。从机制分析显示，土木香内酯增敏奥沙利铂诱导结肠癌细胞凋亡可能是通过激活ROS介导的JNK和p38MAPK信号通路作用的，且提示联合药物递送方法有望成为未来结肠癌的有效治疗手段。
实验方法：
1.土木香内酯联合奥沙利铂的体外抗结肠癌活性研究
采用MTT法检测单独或组合的土木香内酯和奥沙利铂对结肠癌细胞HCT-116和RKO增殖作用的影响。采用流式细胞仪、DAPI染色和荧光显微镜拍照技术检测联合给药对细胞内活性氧(ROS)水平的影响。采用流式细胞仪和WesternBlot检测联合给药对细胞凋亡的影响。通过FCM检测法、DAPI染色和荧光显微镜拍照检测联合给药加入NAC(ROS抑制剂)后诱导HCT116和RKO细胞的ROS产生以及凋亡情况。通过WesternBlot检测HCT116、RKO细胞在单独或者联合作用下p-JNK、p-p38蛋白的表达情况。将HCT116和RKO细胞与JNK抑制剂和p38抑制剂预孵育后，通过WesternBlot检测HCT116和RKO细胞中p-JNK和p-p38蛋白的表达。
2.土木香内酯联合奥沙利铂的体内抗结肠癌活性研究
将人HCT116结肠癌细胞悬浮液接种于BALB/c（nu/nu）雌性裸鼠背部皮下建立移植瘤模型。接种结肠癌细胞后，当裸鼠右侧腹股沟肿瘤体积达到约100-200mm3时，将裸鼠随机分为4组。对照组，土木香内酯组，奥沙利铂组，土木香内酯联合奥沙利铂给药组。每组5只小鼠，每隔一天腹腔注射给药，并通过用游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度，以及记录老鼠体重。采用免疫组化检测联合给药后对裸鼠皮下异位移植瘤的抗肿瘤活性的影响。通过WesternBlot验证在细胞水平上土木香内酯和奥沙利铂联合给药的抗肿瘤分子机制，取出肿瘤组织检测JNK和p38MAPK信号通路相关蛋白表达。
实验结果：
1.MTT结果表明联合给药对HCT116和RKO两种结肠癌的增殖抑制作用比单独给药时效果更好。
2.流式细胞仪凋亡检测结果显示联合给药诱导两种结肠癌细胞的凋亡优于单次给药。实验表明，共同给药的组合抗肿瘤作用是通过促进肿瘤细胞的凋亡来进行的。
3.流式细胞仪ROS检测结果显示，与阴性对照组DMSO及单独给药相比，联合给药刺激ROS的产生比单独给药强，当提前孵育NAC2小时后，联合给药作用刺激ROS产生的作用以及促凋亡的作用被抑制。
4.细胞免疫荧光显示，联合给药诱导两种结肠癌细胞的凋亡比单独给药作用效果好，当提前孵育NAC2小时后，联合作用效果被抑制。
5.WesternBlot结果显示，联合给予两种结肠癌细胞p-JNK，p-p38蛋白表达水平强于单剂量刺激，当用JNK、p38和ROS抑制剂提前孵育后，所述蛋白水平效果被抑制。
6.体内抗肿瘤实验显示，与阴性及单药组相比，联合给药组的肿瘤体积明显较小。此外，联合给药对裸鼠本身毒性相对较低。对各组肿瘤组织进行WesternBlot检测得出，联合给药组JNK、p38蛋白的表达较单药组明显增高。
实验结论：土木香内酯通过上调ROS激活MAPK通路来增敏奥沙利铂从而诱导结肠癌细胞凋亡，我们发现该联合给药方案具有很好的抗结肠癌作用。所有的这些实验研究结果都足以证明我们实验设计的准确性，也为今后提供了一个较好的抗肿瘤治疗候选组合药物。