第一部分脂联素抑制冠脉搭桥术后静脉桥血管再狭窄的研究目的冠状动脉粥样硬化性心脏病（CAD）是如今患病人类死亡的重要原因,CABG是CAD的有效外科治疗手段。大隐静脉因取材方便、易于处理等优点而作为常用的桥血管之一,但其容易发生术后再狭窄或闭塞而难以维持通畅性。血栓形成、内膜增生、动脉粥样硬化等诸多机制导致大隐静脉再狭窄,如何预防再狭窄并维持其通畅性有着极其重要的临床意义。脂联素（ADP）是具有抗炎、抗动脉粥样硬化、抗凋亡、促血管生成作用的生物因子,由脂肪组织特异性分泌。最新研究表明,脂联素受体可在内皮细胞和成纤维细胞表面表达,并参与静脉移植术后再狭窄过程。本章拟通过建立大鼠自体静脉移植模型进而模拟CABG手术过程,使用不同剂量的ADP蛋白涂抹于移植静脉的血管表面,旨在探讨ADP对移植术后静脉桥血管再狭窄发生过程的影响。方法利用吻合袖带技术将SD大鼠自体颈静脉移植于颈动脉间,建立大鼠自体静脉移植模型。两组不同剂量的ADP（2.5μg和7.5μg）以30%Pluronic F-127凝胶作为载药材料,均匀涂抹于大鼠移植静脉血管表面,以不治疗组（仅自体移植）和涂抹30%Pluronic F-127凝胶组作为对照。观察并比较术后不同处理组间移植静脉管壁厚度,PCNA、VCAM-1和ICAM-1免疫组织化学表达及Western Blot检测等方法评价ADP对移植静脉的影响。结果各组手术均成功,术后28天采集标本对照组移植静脉增厚、管壁僵硬、周围组织粘连较明显,高剂量ADP组静脉无明显扩张,周围组织分离容易。术后从第3天起,ADP处理组移植血管内膜和外膜PCNA指数均明显低于对照组和胶水组（P<0.01）,移植后28天免疫组化检测表明ADP处理组移植静脉VCAM-1和ICAM-1表达明显下调（P<0.01）,Western Blot检测结果呈现相同趋势。术后28天,两组ADP处理组移植静脉的内膜、中膜和外膜厚度均低于对照组和胶水组（P<0.01）,且高剂量ADP相较于低剂量ADP抑制管壁增厚效果更明显（P<0.05）。结论本研究通过建立大鼠自体静脉模型,利用移植静脉表面局部涂抹不同剂量ADP的方式探究ADP对静脉再狭窄的抑制作用。结果显示,脂联素处理可达到抑制内膜和外膜细胞增殖的效果,并下调VCAM-1和ICAM-1的表达。该结果暗示ADP可减轻移植静脉内膜、中膜和外膜增生,并联合下调与再狭窄过程相关的VCAM-1和ICAM-1蛋白的表达,最终达到抑制移植静脉再狭窄的作用。本研究结果为深入研究ADP作用于血管再狭窄的过程奠定基础,为实验阶段研究血管再狭窄提供可行的操作方法。第二部分脂联素转基因家蚕品系的建立及蚕丝材料血管外支架制备目的为解决CABG术后移植静脉再狭窄问题,大量研究致力于明确再狭窄的机制及预防改善的措施。医学跨生物材料等学科交叉领域的兴起,为解决临床医学难题提供了新的视角。ADP在抑制静脉再狭窄方面的作用本研究前半部分已证明,此外,血管外支架也在抑制桥血管再狭窄维持通畅性方面具有重要意义。血管外支架可创造保护性环境促进静脉富含微血管的新外膜形成,还可限制移植静脉植入后的迅速扩张,并向血管施加对称性压力以减轻血管壁张力,形成层流并减少异常血流动力。联动ADP和血管外支架的作用共同抑制桥静脉再狭窄是本研究的主要问题。蚕丝优异的力学性能、良好的生物相容性和可调节的生物降解性等特点,符合防治移植静脉再狭窄的血管外支架材料应具备的条件。生物学领域,利用转基因技术以家蚕作为生物学反应器重组表达外源蛋白的技术日趋成熟。本章研究通过家蚕中部丝腺表达系统重组表达外源蛋白策略,构建可遗传的ADP转基因家蚕品系,高效、快速获得大量具有生物学活性的ADP;在此基础上,应用ADP转基因蚕丝制备非限制性ADP蚕丝血管外支架,并通过材料学研究方法分析其性能,为开发使用转基因蚕丝的血管外支架新型材料防治移植静脉再狭窄奠定研究基础。方法利用家蚕丝胶表达系统构建rh ADP转基因表达载体,通过显微注射技术注入Dazao家蚕蚕卵中,荧光筛选rh ADP转基因蚕茧。通过SDS-PAGE和Western Blot检测及定量rh ADP蛋白,获得稳定的rh ADP转基因家蚕品系。提取基因组以明确ADP基因的插入位点,通过免疫荧光实验检测rh ADP蛋白在蚕丝中的分布。调查rh ADP转基因家蚕品系的经济性状,比较rh ADP转基因蚕茧与WT蚕茧微观结构、二级结构及力学性能。提取并浓缩rh ADP蛋白,通过毒性实验、促细胞增殖及抗炎活性检测rh ADP的生物学活性。使用rh ADP转基因蚕茧作为材料制备血管外支架,并通过扫描电镜、FTIR、力学性能检测和吸水性检测对血管外支架进行表征。结果成功建立rh ADP转基因家蚕品系并在转基因蚕丝中检测到rh ADP蛋白的表达;通过Western Blot定量估算得到每克蚕丝中约含有7mg rh ADP蛋白,同时发现家蚕对rh ADP的表达存在修饰,蛋白存在聚体结构。鉴定rh ADP基因插入位点时发现ADP基因以单拷贝形式插入家蚕第10号染色体。从rh ADP转基因蚕茧中提取并浓缩蛋白,细胞水平实验结果显示家蚕表达的rh ADP蛋白无明显细胞毒性,可促进3T3-L1前脂肪细胞增殖,并可抑制LPS诱导巨噬细胞raw264.7的炎症反应。rh ADP转基因蚕丝与WT蚕丝相比,微观结构、二级结构及力学性能无明显差异,且不影响蚕茧产量。成功制备rh ADP转基因蚕茧制备的血管外支架,扫描电镜显示外支架纵切面成蜂窝状结构,二级结构分析外支架β-折叠含量明显升高,力学性能检测显示血管外支架断裂强度达到0.14MPa,吸水性检测显示外支架吸水随着时间延长逐渐饱和,未发生明显形变,最终重量达到初始重量的100倍左右。结论本研究以家蚕作为生物反应器利用ser-1表达系统在家蚕丝胶层表达rh ADP蛋白,建立rh ADP转基因家蚕品系。同时提取浓缩获得大量具有生物学活性的rh ADP蛋白。此外,鉴于蚕丝具备作为血管外支架的条件,创新性的利用rh ADP转基因蚕丝材料研制出非限制性血管外支架,通过医学与生物材料交叉研究初探其可行性与应用性。