发育的过程需要许多基因参与,这些基因在不同的时间、空间表达,完成各自的功能。转录因子可以直接靶向下游基因的转录调控区域,激活或抑制下游基因的转录,调控下游基因的时空表达,因此转录因子在发育中具有重要作用。M EIS1是TALE同源域转录因子,其在胚胎发育中发挥重要的作用。在模式动物中的研究发现,MEIS1缺失造成神经系统发育出现异常,表明MEIS1在神经系统发育中有着重要作用。因此,MEIS1基因功能及其调控作用的研究对神经系统发育等具有重要意义。本文运用CRISPR/Cas9技术,建立了Dox诱导Cas9表达的293T-iCas9细胞株,并利用该细胞株建立了MEIS1基因敲除的293T细胞株。文献报道,小鼠眼部发育中Meis1调控转录因子Pax6表达。而PAX6在小鼠与人具有不同的功能,尤其是在人类神经外胚层分化中,PAX6被认为是人类神经外胚层分化的决定性因子。为了初步探明MEIS1是否对人类PAX6基因表达具有调控作用,我们首先在人PAX6启动子及增强子区域预测了MEIS1可能的结合位点,并根据预测结果构建了PAX6启动子及增强子区域的荧光素酶报告载体。将PAX6荧光素酶报告载体转入MEIS1敲除的293T细胞株中,初步探索MEIS1对PAX6的转录调控机制。1.建立诱导Cas9表达的HEK293T细胞株CRISPR/Cas9是新一代基因组编辑技术,可简便快捷地在哺乳动物细胞对基因进行敲除、敲入。但常规的CRISPR/Cas9表达系统直接转染效果差、病毒包装效率低,这极大地限制了CRISPR/Cas9系统的广泛使用。本研究应用Tet-on系统,构建了四环素(Dox)诱导Cas9表达的慢病毒载体pTight-Cas9-GFP-Puro。将pTight-Cas9-GFP-Puro与p SIN-rtTA-neo共同瞬时转染至293T细胞中,通过荧光显微镜观察、Western Blotting检测等方法,对该诱导Cas9表达的系统进行鉴定。将pTight-Cas9-GFP-Puro载体与pSIN-rtTA-neo载体包装病毒,共同感染HEK293T细胞,加puro药物筛选。添加Dox激活Tet-On系统诱导Flag-Cas9-P2A-GF P表达,流式细胞术单细胞分选表达GFP的293T细胞,并将单细胞接种到96孔板。单克隆细胞扩大培养,添加Dox,再通过荧光显微镜观察、Western Blott ing等方法检测,对诱导Cas9表达的293T细胞株进行鉴定。结果表明,我们成功建立了Dox诱导Cas9表达的293T细胞株,并命名为293T-iCas9。2.运用CRISP/Cas9建立MEISI敲除的293T细胞株髓细胞异位病毒整合位点(MEIS,the myeloid ectropic viral integration site)家族包括MEIS1、MEIS2、MEIS3三个成员,它们都属于TALE(three amino ac id loop extension)同源域转录因子,在胚胎发育、疾病发生发展中发挥重要作用。MEIS1主要在神经系统、造血系统、白血病中发挥作用。虽然MEIS1基因已经被广泛研究,但其作用机制仍未完全明确。因此,MEIS1基因的敲除对研究神经系统发育及发育过程中的转录调控事件具有重要意义。向293T-iCas9细胞株添加Dox,再将靶向MEIS1 Exon3的sgMEIS1表达载体(pLKO5.sgRNA.EFS.t RF P)转入293T-iCas9。SURVEYOR assay和Western Blotting检测表明,sg MEIS1有效地指导Cas9进行基因组编辑。293T-iCas9细胞株表达GFP和Cas9,而sg M EIS1表达载体表达RFP和sgMEIS1,因此用GFP和RFP可以作为CRISPR/Cas9系统是否成功引入的标记。流式细胞术分选表达GFP/RFP的单细胞,再经过Western Blotting检测和基因型鉴定,结果表明我们在HEK293T细胞中高效成功敲除了MEIS1基因。3.MEIS1对人类PAX6启动子及增强子的转录调控作用研究PAX6是人类神经外胚层决定性转录因子,为了初步探明MEIS1对PAX6是否具有转录调控作用,我们首先在人类PAX6启动子和增强子区域预测了M EIS1可能的结合位点。之后,我们克隆了人类PAX6的P0、P1启动子,并将该启动子连接到pGL3荧光素酶报告载体。293T细胞内源表达MEIS1,我们以293T作为对照组、MEIS1敲除293T作为实验组,Luciferase实验检测了MEIS1对PAX6启动子的作用。接下来,我们克隆了具有预测MEIS1结合位点的增强子区域,并将这些增强子分别连接到P0-pGL3、P1-pGL3荧光素酶报告载体上,Luciferase实验检测MEIS1对PAX6增强子的作用。