论文部分内容阅读
目的：(1)血管损伤所致的血管疾患目前是全球范围内发病率及死亡率最高的疾病之一。近来研究发现PI3Kγ在炎症、氧化应激、心血管疾病及组织损伤、修复中起重要作用。本研究旨在探讨PI3Kγ在小鼠血管损伤中的作用及机制。(2)越来越多的证据表明血小板参与血管炎症的发生发展,本研究旨在探讨血小板PI3Kγ在血管损伤中的作用及机制。方法：(1)在小鼠颈动脉结扎模型基础上比较野生型(WT)及PI3Kγ基因敲除小鼠血管损伤反应。采用病理形态学分析新生内膜形成情况,并用免疫荧光及免疫组化法检测损伤血管炎症细胞浸润及NF-κB表达,RT-PCR检测炎症介质的表达, DHE染色检测血管壁活性氧生成。体外实验中采用MMT法及细胞划痕实验、transwell小室迁移法比较野生型PI3Kγ基因敲除血管平滑肌平滑肌细胞增殖及迁移。(2)在小鼠颈动脉部分结扎模型上反复静脉注射活化的血小板。采用病理形态学分析颈动脉中膜-内膜厚度,免疫荧光法检测血管炎症细胞浸润,明胶酶谱法检测受损血管局部MMP-9的活性,实时荧光定量PCR检测损伤血管局部炎症介质包括炎症因子(TNF-α、IL-6)及粘附分子(VCAM-1,ICAM-1)的表达,DHE染色检测血管壁活性氧生成。体外实验中采用流式细胞术检测血小板表面分子表达、活性氧生成、血小板白细胞聚集物形成,western blot检测血小板Akt及p-38表达及活化,血小板、内皮细胞共培养检测血小板-白细胞相互作用。结果：(1)血管损伤后3天、7天白细胞浸润明显,其中第3天以中性粒细胞为主,第七天以单核巨噬细胞为主,而PI3Kγ基因敲除小鼠损伤血管局部炎症细胞浸润均明显减少；PI3Kγ基因敲除小鼠损伤血管局部的细胞因子(TNF-α和IL-6)及粘附分子(ICAM-1和VCAM-1)及NF-κB表达减少。(2)血管损伤后PI3Kγ基因敲除小鼠活性氧的生成较WT小鼠明显降低。(3)血管损伤后PI3Ky基因敲除小鼠新生内膜形成较WT小鼠明显减少,血管平滑肌细胞向内膜的增殖迁移减少；体外实验显示PI3Kγ-/-血管平滑肌增殖及迁移能力降低。(4)颈动脉部分结扎模型显示小鼠反复注射ADP活化的血小板后血管内膜-中膜增厚血管重塑明显,而注射PI3Ky-/-血小板后此作用明显减弱。(5)WT血小板注射小鼠损伤血管的炎症细胞浸润、炎症介质表达、MMP-9活性及活性氧生成明显增多；而PI3Kγ-/-血小板注射小鼠血管炎症细胞浸润、炎症介质表达、MMP-9活性及活性氧生成增多不明显。(6)体外实验研究发现ADP不能诱导PI3Ky-/-血小板Akt、p-38活化,不能诱导PI3Ky-/-血小板活化。(7)ADP不能诱导PI3Kγ-/-血小板NADPH酶活化及活性氧生成。(8)ADP诱导的血小板-白细胞聚集物形成及血小板-内皮细胞粘附中PI3Kγ-/-血小板较WT血小板明显减弱。结论：(1)PI3Kγ介导血管损伤后的炎症反应、活性氧生成及新生内膜的形成。(2)血小板PI3Kγ通过调节血小板活化、氧化应激及其与白细胞、内皮细胞的相互作用介导血管损伤后的炎症反应、活性氧生成及新生内膜形成。展望：PI3Ky可能作为心脑血管疾病的一个治疗靶点,同时血小板PI3Ky可作为心脑血管疾病中抗血小板治疗的一个新的研究方向。