禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli, APEC)能引起禽类局部或全身性感染。全身感染即大肠杆菌型败血症,主要特征是大肠杆菌存在于血液中,其发展阶段包括急性败血症、亚急性多发性浆膜炎和慢性肉芽肿性炎症。局部感染性禽大肠杆菌病包括大肠杆菌型脐炎／卵黄囊感染、大肠杆菌型蜂窝织炎、肿头综合征、生殖道感染、大肠杆菌型输卵管炎／腹膜炎和大肠杆菌型睾丸炎／附睾炎等。大量国内外研究表明,因地理区域不同,大肠杆菌血清型呈现多样性,但最常见的为O1、02、O35、O78。某些感染的暴发病例是由不常见的血清型造成的,如O111血清型分离株可造成产蛋母鸡发生多脏器的浆膜炎、败血症。还有一些致病性大肠杆菌菌株血清型不明确或者不能分型。近年来,在江苏、山东、安徽、河南等省规模化肉鸡养殖场频繁出现一种雏肉鸡“黑腺胃病”(暂命名),发病区域分散,发病日龄早,主要集中在3-5日龄,有时在7-8日龄出现,死淘率3%～12%。商品肉鸡出雏时外观健康,死亡前几无可见临诊症状。剖检病理变化以腺胃呈灰黑色为主(发黑程度随病情轻重而呈浅灰色或灰色,严重时呈黑色)、病程稍长者,可见心包炎、肝周炎、气囊炎。迄今,具有腺胃变黑变化的肉雏鸡疾病尚未见报道。本研究旨在对临床以腺胃发黑为特征的病死肉雏鸡进行病原的分离鉴定,人工感染复制肉雏鸡“黑腺胃病”,探明所分离的致病性大肠杆菌血清型、致病性、种系发生群、毒力基因型；选择从同一病死个体腺胃分离的APEC 4d/9-1 O142菌株和APEC 4d/9-1 O142心血分离株进行毒力基因和模型动物的致病性比较,通过DNA芯片技术对这两个分离株在SPF鸡体内和体外的基因表达谱进行分析,筛选APEC腺胃分离株潜在的毒力基因；选择表达差异基因进行缺失株的构建,评价基因缺失株与致病性的关系,最终为弄清APEC引发雏肉鸡“黑腺胃病”的发病机制和防制措施提供依据。1.致雏肉鸡“黑腺胃病”致病性大肠杆菌的分离鉴定本试验对江苏省某大型肉鸡养殖场雏肉鸡“黑腺胃病”病例进行了病原的分离鉴定,同时对该养殖场不同日龄死亡鸡胚、饲料、出雏器和鸡舍空气进行大肠杆菌的分离鉴定。共分离获得大肠杆菌96株,除5株未能定型外,共鉴定出88个分离株的O血清型,优势血清型分别为：O142、O45、O86和078,其中0142共有46个分离株,占本次定型菌株的52.27%(46/88),且0142血清型为首次在致死鸡中分离到。用分离到的优势血清型0142大肠杆菌分离株进行了人工感染,结果该病原人工感染易感肉鸡能复制出与临诊几乎一致的疾病。选择来自病死鸡中同一个体的腺胃和心血分离株各10个,以107菌落形成单位(colony forming units, CFU)分别气囊感染1日龄健康易感肉鸡和SPF鸡,结果显示所有腺胃分离株恒能引起2种鸡6/6(100%)死亡,而心血分离株则可引起3/6-4/6(50-67%)的鸡死亡。腺胃分离株接种后病死肉鸡83%-100%(5-6羽)腺胃变黑,而心血分离株接种的病死肉鸡以及所有病死的SPF鸡的腺胃无此变化。毒力基因检查结果显示,绝大部分菌株都携带iutA,fimH,frzorf4, ompT和feoB基因(≥88),50%以上分离株都携带cvaC, iroN, iucC, iucD, sitA, traT, irp-2, tsh, astA和neuC,而afa, papA, papG allele I, sfa, sfaS,fela, cdtB,vat和ace26基因检出率均低于10%。分离株种系发生分型结果显示,以B2为主,占受试分离株的58.33%,D型、A型和B1型分别占11.46%、19.79%和10.42%。药敏试验结果显示,分离株呈多重耐药性,尤其大部分0142血清型分离株均对头孢噻呋钠耐药。重金属检测结果显示所有病死鸡的内脏组织中汞均超标,而发病鸡舍污染饲料和试验对照鸡内脏均不超标。试验结果表明分离的分离株经气囊接种肉鸡和SPF鸡均为高致病株；死亡鸡胚和病肉鸡舍料槽中污染的饲料样品中,可分离出与雏鸡病例一致的0142致病性大肠杆菌,暗示饲料可能成为同群易感肉鸡致病性大肠杆菌的来源；汞不是造成雏肉鸡死亡和黑腺胃的原因,但可能加重黑腺胃变黑的程度。2.同一个体APEC腺胃分离株和心血分离株毒力基因及致病性比较为探明前期研究中从同一病死个体腺胃分离的APEC 4d/9-1 O142菌株和APEC 4d/9-10142心血分离株是否为相同菌株及评价两者对动物的致病性。首先对两株菌进行了半数致死量(LD50)测定及体内定居与持续试验。半数致死量结果显示APEC 4d/9-1 O142腺胃分离株比APEC 4d/9-1 O142心血分离株的毒力高100倍；体内定居与持续试验结果显示,腺胃分离株在感染鸡肺内的细菌载量比心血分离株高10倍(P<0.01),在心血、肝脏、肾脏和腺胃则高100倍(P<0.001),腺胃分离株可使人工感染病死的AA肉鸡的腺胃变黑,但病死SPF鸡腺胃不变黑。动物试验结果表明：来自同一个体的4d/9-1 O142腺胃分离株的毒力确实显著高于4d/9-1 O142心血分离株。为进一步阐明这两个菌株之间的差异,本研究对二者的毒力基因、种系发生群、多位点序列分型和脉冲场凝胶电泳进行了检测。毒力基因检测结果显示：在受检的32个毒力基因中,铁摄取基因、保护素基因的出现率相对较高,而粘附素、毒素基因的出现率相对较低,腺胃分离株仅比心血分离株多了1个铁摄取相关的毒力基因feoB。两个分离株均属B2分子发生群；但多位点序列分型显示腺胃分离株为ST131,而心血分离株为ST2704,表明尽管分离自同一个体,但2个分离株基因组水平确实存在差异；脉冲场电泳显示两者的相似系数为97.3%,说明二者存在着遗传差异。3.APEC O142腺胃分离株和心血分离株在鸡体内外的表达差异基因的筛选O142是一个十分罕见的禽源性大肠杆菌的血清型,前期研究结果显示来自同一个体的O142腺胃分离株和心血分离株都属强毒株,但前者毒力比后者高100倍。已知毒力基因检测结果显示,除了前者少一个feoB基因外所有毒力基因完全相同,已有研究表明feoB基因与致病性大肠杆菌致病性无关。为此,本研究选择APEC4d/9-1 O142腺胃分离株和心血分离株为研究对象,应用商品化大肠杆菌基因芯片对选择的致病性大肠杆菌分离株进行以SPF鸡作动物模型的体内外表达基因谱检测,筛选部分潜在的新毒力基因。该芯片系统共包含10113条探针,因此,可以实现大规模潜在毒力基因的筛选。试验结果显示,APEC4d/9-1腺胃分离株和心血分离株在体内比体外差异表达基因数量分别达到1502个和2260个。APEC 4d/9-1腺胃分离株体内对体外表达差异分析结果显示,在1502个差异表达基因中表达上调的基因为527个,其中包含195个特异性探针对应的已知基因,68个假定基因；表达下调的基因为975个,其中包含217个特异性探针对应的已知基因,83个假定基因；5倍以上差异基因共97个,其中表达上调基因和下调基因分别为41个和56个。表达差异最显著的基因是narG, narU, narJ, narH, nark, narl, ompF, metF和nanA基因。4d/9-1心血分离株体内对体外表达差异分析结果显示在2260个差异表达基因中表达上调的基因为651个,其中包含146个特异性探针对应的已知基因,78个假定基因；表达下调的基因为1609个,其中包含281个特异性探针对应已知基因,75个假定基因；5倍以上表达差异基因共177个,其中包含上调表达差异基因为44个,下调表达差异基因为133个。上调表达差异最显著的基因是narU, narG, narH, narJ, nark, ompF, metF,pta,fdnG, gpmM和nanA基因等。腺胃分离株与心血分离株体内分别与各自的体外表达谱相比上调或下调基因数量较多,但与心血分离株的体内表达谱相比,腺胃分离株在体内差异表达基因数量较少,共159个差异表达基因,原因可能是两者是从同一个体内分离出、同一血清型O142,种系发生群同属B2群,虽然ST分型及动物试验结果显示两者为两株菌,但很可能两者的同源率较高。在159个差异表达基因中包含了上调表达基因126个,其中差异表达基因最显著为yehX, nrfG, lamb, ompF, gadB, ynjE, ygaM, yeiC, gltD和metF; 4d/9-1腺胃分离株与4d/9-1心血分离株相比共有33个下调表达差异基因,差异表达基因最显著为leuB, nhaR, sdaB, yghJ, ytfQ, ycdT, c2481, kpsM, C3689和ECsl505。对4d/9-1腺胃分离株与4d/9-1心血分离株分离株在鸡体内差异表达基因进行Gene ontology(GO)分析,结果显示,GO注释结果中cell part, binding, catalytic, transporter, cellular process, metabolic process功能所占的比例最大。暗示这些基因在致病性大肠杆菌感染鸡体内生长繁殖及发挥致病作用时有主要作用。用qRT-PCR方法,分别对感染鸡体内表达上调的yjhQ, C3292, nuoM, narH, metF, ompF基因和表达下调的。fimA,C0719,yjdB,yedV基因表达做了解析验证。结果显示,除了表达上调的nuoM和表达下调的yjdB基因与基因芯片结果存在一定差异外,其他验证基因均与芯片结果一致。4.禽致病性大肠杆菌E491P株ompF, metF基因缺失株的构建及其生物学特性研究对在基因芯片试验中筛选出的APEC4d/9-1腺胃分离株(4d/9-1 proventricular isolate, E491P)体内外呈显著差异表达基因ompF和metF基因,利用λRed重组系统分别构建ompF和metF基因缺失株E491P△ompF和E491P△metF,研究两个缺失株的生物学特性。试验结果显示,缺失株E491P△ompF和EA91P△metF的生长速度、抗血清补体杀菌能力较野生株无显著差异,但缺失株△ompF生长速度略低于野生株。1日龄雏鸡LD50致病性试验结果显示,野生株E491P、缺失株E491P△ompF和E491P△metFLD50分别为1038、1050和1040,结果表明仅缺失株E491P△ompF致病性被致弱；35日龄SPF鸡体内动态分布试验结果显示,缺失株AompF在鸡体内定植能力显著下降,而E491P△metF较野生株致病性没有明显差异,结果表明ompF基因与致病性大肠杆菌致病性相关。