花生ω-3脱氢酶基因克隆、表达有活性分析

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多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)指含有两个或两个以上双键且碳链长为16-22个碳原子的直链脂肪酸。根据多不饱和脂肪酸分子的甲基端起第一个不饱和双键所连结的碳原子在碳链中的位置不同,将PUFAs分为ω-3和ω-6两类。α-亚麻酸(alpha-1inolenicacid,ALA)是ω-3多不饱和脂肪酸中的一种,它对促进人体健康具有很重要的作用,尤其可以促进大脑发育。ALA是EPA和DHA等有益长链多不饱和脂肪酸的合成前体物质,它可以通过竞争同种酶消耗抑制ω-6脂肪酸的延伸从而达到降低ARA含量的目的,平衡人体内ω-3与ω-6脂肪酸的水平。但是,由于人类不能直接合成,所以只能从饮食中摄取。花生是世界第四大油料作物,花生油中大约含有油酸和亚油酸80%。目前,花生中脂肪酸脱氢酶的研究多集中在ω-6脂肪酸脱氢酶,并且FAD2和FAD6基因已经相继被克隆并验证了功能,而对于ω-3脂肪酸脱氢酶的研究比较少。   本研究基于实验室建立的花生转录组PeanutBD数据库,利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)注释绘制了花生中脂肪酸脱氢酶的主要合成途径。并克隆了花生ω-3脂肪酸脱氢酶中的FAD8基因,命名为AhFAD8,并在GeneBank上登录。通过对该基因的结构进行的生物信息学分析和预测显示,该脱氢酶含有4个跨膜结构域及3个组氨酸box,与脱氢酶的结构特点相符。构建了含AhFAD8基因的酵母表达载体,诱导其在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达,利用气相色谱法分析酵母的脂肪酸组分,转AhFAD8基因的酵母中亚油酸的去饱和率比转空载体的酵母中的增加了约25.5%,经统计学分析两者差异显著,结果表明AhFAD8基因在毕赤酵母中有脱氢酶活性,为新一代的油料作物品质改良育种奠定基础。分析花生(白沙1016)以及单胞藻(Monodus subterraneus)转录组数据,对不饱和脂肪酸合成中的相关基因进行了发掘。单胞藻是一种高产ω-3类PUFAs的微藻,通过对转录组测序结果的分析和基因功能注释,获得多不饱和脂肪酸合成途径所有相关基因139条,包括ω3、ω6脱氢酶及延伸酶等不饱和脂肪酸合成途径的相关酶基因;为得到花生及单胞藻全长功能基因提供了依据,并为进一步研究花生和单胞藻不饱和脂肪酸合成途径和影响因素奠定了基础。
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