虾养殖业带来巨大的经济价值,在全世界范围内受到高度关注。随着环境生态的日益紧张,集约化养殖模式的发展壮大,营养供给的逐渐失衡以及包括细菌、病毒、真菌和寄生虫等在内的多种病原的侵袭,使得虾类病害频发,并给整个水产养殖业造成了一定的经济损失。鉴于此,研究虾类抵抗病原体感染的免疫应答机制对疾病防控具有深远意义。凝集素在病原识别和清除过程中发挥重要作用,但目前对C-型凝集素和L-型凝集素在先天免疫防御中的功能研究却依然有限。Toll信号通路在回应革兰氏阳性细菌和真菌感染,进而调节抗菌肽表达的体液免疫过程中发挥重要作用。作为Toll信号通路中的关键转录因子,Dorsal参与调控抗肽的表达。小G蛋白参与多种细胞生命活动,已有的研究表明在对虾感染病毒的过程中,小G蛋白具有调控血细胞吞噬的作用。为了阐明以上免疫相关基因在甲壳类动物先天免疫系统中的具体功能与作用机制,本研究选取沼虾和对虾作为实验动物,研究了一种含发夹结构域（Clip）的C-型凝集素（Mn-clip-Lec）、一种L-型凝集素（MrVIP36）、Toll信号通路关键转录因子Dorsal（MrDorsal）以及三种Ras小G蛋白（MjRap,MjRas和MjRal）在宿主抗细菌和（或）抗病毒先天免疫防御中的作用。本研究得到如下结果:1.日本沼虾含Cl ip结构的C-型凝集素在细菌感染过程中的功能研究我们在日本沼虾中发现了一种以前没有报道过的含Clip结构域的新的C-型凝集素,命名为Mn-clip-Lec。该凝集素的cDNA全长为1315 bp,含有一个1098 bp的开放阅读框,编码一个包含365个氨基酸残基的蛋白,该蛋白包含一个Clip结构域在N-端以及两个C型凝集素样结构域在C-端。Mn-clp-Lec在血细胞中表达相对较高。在受到金黄色葡萄球菌刺激后,Mn-clip-Lec、酚氧化酶原激活系统主要成员（MnPPAF,MnPPAE和MnPo）以及抗菌肽（MnALF和MnCRU）的表达量明显上调。利用RNA干扰敲低Mn-clip-Lec会减少金黄色葡萄球菌刺激后酚氧化酶原激活系统主要成员和抗菌肽的表达。此外,Mn-clip-Lec基因沉默会降低金黄色葡萄球菌刺激后总血淋巴PO活性。纯化的Mn-clip-Lec重组蛋白（rMn-clip-Lec）能够结合5种细菌且结合活性不同。rMn-clip-Lec能够凝集金黄色葡萄球菌且这种凝集活性依赖钙离子。rMn-clip-Lec可以结合病原菌表面的多糖,如脂多糖（LPS）和肽聚糖（PGN）。在结合金黄色葡萄球菌后,rMn-clip-Lec可以在日本沼虾体内促进机体对该菌的清除作用。这些结果表明作为含Clip结构域的C-型凝集素,Mn-clip-Lec参与包括病原识别、诱导酚氧化酶原系统的活化以及调控抗菌肽的表达在内的先天免疫应答。在以上研究的基础上,我们进一步运用酵母双杂交技术从日本沼虾cDNA文库中筛选出了可能与Mn-clip-Lec存在相互作用的蛋白,但需要进一步的验证。这些筛选结果为进一步研究机体对抗病原体入侵的先天免疫应答机制奠定了基础。2.罗氏沼虾L-型凝集素对细菌和病毒感染的免疫应答研究我们从罗氏沼虾中克隆得到了一个L-型凝集素,命名为Mr VIP36。MrVIP36的cDNA全长为1687 bp,开放阅读框为972 bp,共编码323个氨基酸。预测的MrVIP36蛋白包含一个L-型凝集素样结构域（LTLD）和一个跨膜区。进化分析显示,与脊椎动物相比,MrVIP36与无脊椎动物L-型凝集素的进化距离更近。Mr VIP36广泛分布在健康的罗氏沼虾的不同组织,其中在肝胰腺和肠中尤为丰富。在金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌以及白斑综合征病毒（WSSV）刺激后,血细胞中MrVIP36的表达明显上调。MrVIP36的LTLD结构域重组蛋白（rMrLTLD）能够结合所有测试的细菌,并且以钙离子依赖的形式凝集金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌。rMrLTLD还可以结合脂多糖（LPS）和肽聚糖（PGN）。此外,rMrLTLD能够在体外抑制细菌的生长,并且在体内促进机体对侵入的细菌的清除。rMrLTLD与WSSV共同孵育后能够抑制WSSV在罗氏沼虾体内的复制。同时,存活率分析也表明rMrLTLD能够减少WSSV感染罗氏沼虾后导致的死亡。这些结果表明MrVIP36可能作为模式识别受体,在罗氏沼虾的抗细菌和抗病毒免疫中发挥重要作用。3.罗氏沼虾Dorsal转录因子在WSSV感染过程中调控甲壳肽的表达我们在罗氏沼虾中鉴定了一个Dorsal同系物,命名为MrDorsal。它的全长cDNA为2533 bp,含有一个1986 bp的开放阅读框,可以编码661个氨基酸。氨基酸序列分析显示MrDorsal含有一个Rel同源结构域（RHD）和一个IPT/TIG结构域,并且包含Dorsal蛋白的特征序列FRYMCEG。MrDorsal在血细胞和鳃中的表达高于在其他组织中的表达。WSSV刺激引起了 MrDorsal与甲壳肽（MrCrustin2和MrCrustin4）的表达增加。沉默MrDorsal会抑制病毒感染后鳃组织中以上两种甲壳肽的转录。这些结果表明在病毒感染罗氏沼虾的过程中,MrDorsal参与调控甲壳肽的表达并发挥重要的免疫作用。4.日本囊对虾小G蛋白家族的3个成员在WSSV感染过程中的功能鉴定我们对日本囊对虾Ras小G蛋白家族的3个成员（分别命名为MjRap、MjRa和MjRal）进行了克隆和鉴定。MjRap、MjRas和MjRal的cDNA全长分别为1236、1330和2074 bp,分别拥有570、609和597 bp的开放阅读框,并分别编码189、202和198个氨基酸。进化分析显示来自不同物种的Rap、Ras和Ral分别聚集在一起。MjRap、MjRas和MjRal广泛分布在健康对虾的血细胞、肝胰腺、鳃、胃和肌肉中。在受到WSSV刺激后的48和72 h,MjRal在鳃中的表达上调,而MjRap和MjRas的转录水平没有变化。进一步研究发现利用RNA干扰沉默MjRal基因后能够显著增加WSSV的拷贝数。此外,体外重组表达的MjRal蛋白（rMjRal）与WSSV共孵育后注入对虾体内,48 h之后检测鳃中VP28的表达和病毒拷贝数。结果显示VFP28的表达没有明显变化,然而病毒拷贝数却明显降低。这些结果表明只有MjRal能够抑制病毒在日本囊对虾体内的复制,并在抵御病毒感染的免疫反应中发挥重要作用。