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吡咯喹啉醌(PQQ)是一种具有氧化还原活性的芳香三环邻位醌,参与脱氢酶的氧化还原过程,协同COQ完成呼吸链的电子传递,是继核黄素和吡啶核苷酸之后发现的第三种氧化还原酶辅因子。PQQ广泛存在于生物体内,具有促进机体生长、防护肝损伤、维护线粒体功能、促进神经生长因子合成、调节机体自由基水平、防止皮肤衰老、防治帕金森病和老年痴呆症等功能,是一种独特的生理活性物质,在医药、食品和化妆品领域具有广阔的应用前景。因此,选育PQQ高产菌株并建立相应的发酵控制及纯化制备工艺具有重要的意义。1、定向驯化选育高产PQQ的甲基营养菌:根据PQQ的吸收光谱特性建立了光谱法结合液相色谱法的PQQ产生菌快速筛选体系,从化工污水中筛选获得蛋白分泌量低而PQQ合成量超过20 mg/L的甲基营养菌FJNU-6,经形态学观察、生理生化测定及系统发生分析命名为脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans);利用紫外线和亚硝基胍轮流间隔诱变提高突变率,以高浓度甲醇为拮抗因子进行8轮定向驯化,选育获得高产突变株FJNU-R8;突变株FJNU-R8在不同甲醇浓度下pqq和moxF基因簇的表达量较高且差异较小,但生长速度较慢,甲醇消耗速度快,PQQ产量达到 65.73±1.65 mg/L(132 h),比出发株FJNU-6(30.61±3.69 mg/L,160h)提高了 1.17倍。2、建立DO-stat结合pH-stat的甲醇分段控制补料分批发酵工艺:通过单因素试验设计、析因设计及中心组合设计对H.denitrificans FJNU-R8产PQQ的摇瓶培养体系进行优化,PQQ产量提高至135.67±2.34 mg/L;5L发酵罐的分批培养数据发现培养液中较低的溶氧和pH有利于PQQ的合成,动力学模型表明FJNU-R8产PQQ属于生长部分偶联型发酵,甲醇是PQQ合成的限制性底物;建立DO-stat和pH-stat相结合的分段甲醇浓度控制补料分批发酵工艺,5L发酵罐中PQQ产量达到1.18 g/L,生产效率为52.17 mg/g DCW;按照单位体积培养液所消耗的搅拌功率相同为准则进行5L-50L-1T发酵参数的逐级放大,1T发酵罐的PQQ产量高达2.05 g/L,生产效率达到77.82 mg/g DCW,比5L发酵罐提高49.17%。3、建立离心结合膜过滤、层析分离耦合色谱纯化的结晶制备工艺:利用离心和膜过滤技术结合添加15%的硫酸铵完全去除发酵液中的菌体和95%的蛋白多肽,防止发酵液变绿,提高了 PQQ的稳定性;通过静态吸附试验,确定大孔树脂DK-6和缓冲液为PQQ富集纯化的分离介质和解析剂;动力学研究表明,树脂DK-6对PQQ的吸附属于优惠型化学吸附,该吸附过程是一个放热过程,吸附速率由内外扩散共同控制;动态吸附试验确定柱层析条件为:样液浓度1.5 g/L(pH 3.0),以5 BV/h的流速上样6 BV,按体积倍数进行线性放大,PQQ最高可浓缩3.3倍,回收率达到90%;析因设计确定浓度≥3.5 g/L的PQQ母液(pH≤3.0)在4℃条件下结晶5 h,PQQ残留量≤100 mg/L,结晶得率>90%,经过两次结晶,PQQ产品的纯度从90.36%提高至99.32%;根据分离纯化制备参数进行工艺放大,PQQ的最终得率大于70%,纯度高于99%。4、完成H.denitrificans FJNU-R8的基因组测序分析:FJNU-R8的基因组全长3.54M bp,GC含量为60.78%,含有4个CRISPR结构以及1个完整的前噬菌体区域,编码3498个基因,3个rRNA和sRNA以及46个tRNA,与ATCC 51888具有较好的共线性。FJNU-R8基因组只含有I型限制性修饰系统,含有完整的甲醇氧化代谢、硝酸盐还原以及Fe-S簇合成基因,以及丰富的无机盐转运与代谢、信号转导、细胞膜及膜生物合成和转录的相关基因。基因组中还包含由4个独立moxFα基因和1个moxFαβ基因簇组成甲醇脱氢酶体系以及4个独立pqqA基因、1个pqqDE和pqqABCDE基因簇组合的PQQ合成系统。pqq基因簇中各个基因是单独转录的,pqq基因中pqqA3表达量最高,moxF基因中moxFβ表达量最高。5、强化Fe-S的合成和pqqA的表达提高PQQ的合成量:以大肠杆菌为基盘细胞,采用携带阿拉伯糖启动子的表达载体实现pqqABCDE基因簇的异源表达,PQQ产量达到4.09±0.21 mg/L,生产效率为2.16±0.06 mg/g DCW。通过添加30 μM的Fe2+或以IscR缺失菌为宿主,促进铁硫簇的合成,PQQ产量提高到3.13±0.07mg/g DCW;FJNU-R8含有的5个pqqA基因中pqqA3最有利于PQQ的产生,单独表达时PQQ产量达到4.52±0.05 mg/g DCW。当串联表达5个不同pqqA或pqqA3时,PQQ 产量分别为 5.28±0.12 mg/g DCW 和 5.48±0.09 mg/g DCW,而融合 5 个不同的pqqA或pqqA3 时,PQQ 产量仅为 4.89±0.1 mg/g DCW 和 4.78±0.05 mg/g DCW,表明PqqA加工形成PQQ既需要保守结构域还需形成一定的空间结构。综上所述,本论文通过定向驯化选育获得高产PQQ的脱氮生丝微菌,优化了培养体系,建立了分批流加补料生产工艺及色谱分离纯化结晶制备工艺。在此基础上,对高产突变株进行基因组测序分析,以大肠杆菌为基盘细胞分析了铁硫簇的合成和pqqA的表达对PQQ合成量的影响。