绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, MO)是引发绵羊传染性胸膜肺炎的主要致病菌。课题组前期对绵羊肺炎支原体Y98株甘油3-磷酸氧化酶(glycerol 3-phosphate oxidase, GlpO)的研究发现,其编码基因全长1,134 bp,编码377个氨基酸；并证明了该蛋白位于细胞膜上,且能够催化底物甘油3.磷酸生成DHAP及H202。研究认为,GlpO是以CH-OH基团为供体的氧化还原酶类,为黄素腺嘌呤二核营酸(FAD)依赖型氧化酶。GlpO是肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae, MP)、丝状支原体丝状亚种SC型(Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC)标准株PG1、鸡败血支原体(Mycoplasma galliseptic um)等支原体致病的毒力因子之一,主要参与甘油代谢途径,可氧化甘油3.磷酸(glycerol 3-phosphate, G3P)产生H2O2,引起炎症反应导致细胞死亡。氨基酸序列同源比对分析发现,Y98株G1pO与SC型标准株PG1的GlpO、肺炎支原体的G1pD相似性分别达到64%、62%,且在其第15-20位的氨基酸也存在一个可能的FAD结合位点结构域Gly15-Ala16-Gly17-Ile18-Ile19-Gly20。在对FAD结合位点结构研究认为,Gly对维持结构的稳定性及其识别起着关键作用。因此,本实验采用PCR扩增方法获得了MO GlpO可能的FAD结合位点的缺失突变体及该位点上Gly15、Gly17、Gly20的单个Gly缺失突变体,对MO GlpO FAD结合位点进行验证,不同位点Gly对其活性的影响进行研究。主要研究结果如下：①利用实验室前期构建的pET28a-glpO载体为模板,采用大引物PCR法获得glpOFAD结合位点缺失突变体glpO△FAD片段,并将其连接至pET32a表达载体；以pET32a-glpO为模板,通过一步反向PCR法获得三种FAD结合位点单个Gly缺失突变体1)Eg△G15、pEg△G17、 pEg△G20。②将四种GlpO突变体重组质粒转化到BL21(DE3)宿主菌,诱导重组蛋白表达,经SDS-PAGE和Western blot检测,目的蛋白均以包涵体形式存在,大小约为60 kD。利用6 M尿素将包涵体蛋白溶解,设定4M,2M, OM尿素梯度对突变体蛋白及课题组前期表达的GlpO蛋白进行处理,成功获得复性后GlpO及其突变体重组蛋白。③以复性后GlpO蛋白为对照,检测突变体蛋白的氧化酶活性。发现体外条件下,加入FAD时,GlpO蛋白具有氧化酶活性,能够以甘油3-磷酸为底物催化产生H2O2,不加入FAD时无H202产生：而无论是否加入FAD, GlpO整个FAD结合位点缺失及单个Gly缺失突变体重组蛋白都不能催化甘油3.磷酸产生H202,不具有氧化酶活性。验证了Gly15-Ala16-Gly17-Ile18-Ile19-Gly2o确为G1pO的FAD结合位点序列,且Gly15、Gly17, Gly20对该位点与FAD的结合起着关键作用。④将MO、GlpO及四种G1pO突变体蛋白分别作用于小鼠肺脏上皮TC-1细胞,经MTT和ROS检测,发现无论是否添加甘油,FAD结合位点缺失突变体及该位点的三种单个Gly缺失突变体重组蛋白都不能引起细胞产生ROS,均对细胞的存活率无明显影响。表明FAD结合位点6个氨基酸缺失或该位点单个Gly缺失都会使G1pO失去酶活性。本实验通过构建四种GlpO缺失突变体,在蛋白水平、细胞水平对其重组蛋白进行了活性检测,验证了GlpO FAD结合位点的存在,并证明了Gly15、Gly17、Gly20是该位点与FAD结合的关键氨基酸。研究结果丰富了支原体毒力因子相关资料,并为MO的致病机制研究提供了依据。