肝细胞生长因子基因转染兔髁状突软骨细胞及转染细胞对TMD的治疗研究

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目的 观察携带有GFP标记的HGFcDNA的质粒体外转染兔髁突软骨细胞后的主要生物学特性,及其对TMD动物模型的治疗效果。方法 无菌条件下取兔髁状突软骨细胞体外进行原代的培养与增殖,软骨细胞传至第Ⅱ代时以脂质体为载体将GFP标记的HGFcDNA转染软骨细胞,然后在倒置显微镜下观察软骨细胞的细胞形态变化、细胞增殖情况,瞬间细胞的转染率,噻唑蓝(MTT)法检测软骨细胞转染后的增生能力,免疫组化及原位杂交法测其Ⅱ型胶原在转染前后的变化与mRNA的表达水平,HE细胞染色观察细胞形态学的变化。通过绿色荧光光镜下转染细胞的瞬时计数,在视野内取100个细胞进行计数,共取10次,取其均值,得出转染率结果。以胶原酶进行颞下颌关节腔内注射,建立TMD动物模型,将收集的转染后的软细胞进行关节腔内注射,并与对照组(空白质粒组)比较,通过组织切片观察治疗效果。结果 软骨细胞的原代细胞在15%NBS的DMEM中24h后软骨细胞开始舒展,第三天时基本完全贴壁,10d左右长满培养瓶底;原代软骨细胞为多边形和三角形,细胞轮廓清晰,核仁明显。第二代以脂质体为载体的GFP标记的HGFcDNA转染软骨细胞,转染24h后在荧光显微镜下可清楚的看到GFP标记的HGF进入软骨细胞内;软骨细胞在转染后2代左右变的细胞狭长并逐渐变回原来的多变形、三角形,并可加速生长和促进其增殖,Ⅱ型胶原在第Ⅵ代时仍有较强表达,软骨细胞的“退化”现象明显推迟,而对照组软骨细胞Ⅱ型胶原则明显减弱,细胞形态有较大的变异。通过绿色荧光光镜下转染细胞的瞬时计数,基因转染率大约28.50%左右。动物模型显示,转染细胞可促进关节损伤的修复,软骨及胶原的生成多余对照组。结论 GFP标记的HGFcDNA的质粒经脂质体为载体转染软骨细胞后可表达其生物学功能,并可直观的计算其转染率。转染HGF的软骨细胞可促进TMD的治疗。
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