论文部分内容阅读
桑黄是我国传统名贵的药用真菌,具有抑菌、抗肿瘤、清除自由基等作用。由于传统对桑黄物种及学名的争议,使其研究和开发应用受到很大影响,直到近年(2016)才得以澄清。以三萜为代表的活性物质是重要的药用成分,但真正桑黄的三萜类物质还少有关注。本研究以桑黄液体发酵菌丝体为实验材料,探索桑黄总三萜提取方法,并进行相应的生物活性分析。主要研究内容及结果如下:1、对获得的桑黄权威菌株,通过ITS-rDNA序列测定和GenBank 比对分析,进一步分析验证。桑黄菌株的液体发酵表明,获得三萜总产量最佳的发酵时间为11 d。通过响应面法,优化桑黄菌丝体总三萜的超声提取工艺,获得最适的提取方法:100 W条件下超声提取,时间20 min,乙醇浓度80%,温度60℃;总三萜产量可达13.30 mg/g。2、对桑黄总三萜提取物进行化学成分定性分析,从中检测出三萜和有机酸类物质,未检测到黄酮及多糖等物质。进一步通过红外光谱分析,对比吸收峰相应的官能团确定存在羊毛脂烷型三萜类物质。GC-MS分析发现桑黄总三萜提取物中还含有其它一些小分子物质,分离获得34个化合物,分析得到其中30个化合物的结构,其成分含量占色谱总流出物的96.04%,其中酸类物质占到48.78%。3、抑菌活性测定表明,2倍MIC量的桑黄总三萜提取物对大肠杆菌等四种供试细菌均有明显抑制作用,OD260nm检测吸光度明显上升,推测三萜破坏细菌的细胞膜,使胞内物质大量外泄。扫描电子显微镜观察证实细胞形态发生明显变异,细胞出现皱缩,凹陷。在四种供试细菌中,三萜MIC为20 mg/mL时,金黄色葡萄球菌最为敏感,抑菌圈直径为10.22 mm;枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为9.28 mm和9.32 mm;大肠杆菌的抑菌效果相对不明显,抑菌圈直径为8.75 mm。4、测试桑黄总三萜提取物对肿瘤细胞的影响,发现能明显抑制结肠癌细胞Caco-2的增殖,破坏细胞的形态,细胞几乎不能贴在培养板上生长;流式细胞技术分析发现阻滞了细胞周期,诱导结肠癌细胞Caco-2发生程序性细胞凋亡,细胞早期凋亡和晚期凋亡都相应增加;在一定范围内,随着总三萜提取物浓度增大,细胞程序性凋亡也有所增加。5、桑黄总三萜提取物抗氧化能力测定结果表明,对羟自由基、超氧阴离子、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基、2,2’-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)[2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid),ABTS]等都具有较强清除能力,当桑黄总三萜浓度达到300 μg/mL时,对四种自由基的清除能力都达到了90%以上,具有较好的开发应用潜力。