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第一部分重组tMfn2基因腺病毒表达载体的包装及其在VSMCs中的表达1．目的采用脂质体(LipofectamineTM 2000)转染方法将携带tMfn2基因的腺病毒骨架质粒包装成重组腺病毒（Adv-tMfn2），并在体外培养大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）中表达，观察基因转染情况。2．方法利用LipofectamineTM 2000法将经PacI线性化的pAd-tMfn2转染HEK 293A细胞进行包装，待大部分细胞变圆、漂浮后收集细胞。PCR方法证实为复制缺陷型tMfn2基因重组腺病毒，之后进行大量扩增。采用氯化铯梯度离心法纯化病毒，将病毒液进行分装，-80℃保存。利用分光光度计测定重组腺病毒滴度。采用Western blot方法检测tMfn2目的基因在VSMCs中的表达。3．结果融合基因序列正确，PCR可检测到1．3kb的特异性条带并排除野生病毒株。腺病毒Adv-tMfn2滴度为66．424×109pfu/ml。Western blot结果表明Adv-tMfn2感染VSMCs后能有效表达出相应的蛋白。4．结论利用脂质体和293A细胞可在体外方便、快捷地构建携带tMfn2基因的复制缺陷型腺病毒，易进行扩增纯化，从而获得大量高滴度病毒液。tMfn2基因可在VSMCs中高水平表达出目的蛋白，为进一步研究其对VSMCs增殖和凋亡的影响奠定了基础。第二部分tMfn2基因对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响1．目的比较大鼠线粒体融合素基因2（Mfn2）和去除穿膜区序列的线粒体融合素基因2（tMfn2）对大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖的作用，探讨tMfn2基因对VSMCs增殖的影响及其相关的信号通路。2．方法用携带tMfn2基因和Mfn2基因的重组腺病毒（Adv-tMfn2和Adv-Mfn2）感染VSMCs，检测tMfn2蛋白和Mfn2蛋白在细胞中的表达水平；细胞计数法、四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测VSMCs的增殖；流式细胞仪检测tMfn2基因对VSMCs细胞周期的影响；Western blot方法分析各组磷酸化ERK1/2和磷酸化Raf-1蛋白表达水平的变化；采用方差分析对数据进行统计学处理。3．结果Adv-tMfn2和Adv-Mfn2感染VSMCs后能有效表达出相应蛋白；细胞计数和MTT结果显示，tMfn2和Mfn2均使VSMCs增殖受到明显抑制（P＜0．01），且前者较后者抑制效果更明显（P＜0．01）；流式细胞仪检测结果表明tMfn2和Mfn2使多数VSMCs停滞于G0/G1期，细胞比例为88．01±4．38％和67．43±6．21％，可见tMfn2基因对细胞周期的影响更明显（P＜0．01）；进一步研究表明tMfn2和Mfn2降低VSMCs磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）和磷酸化Raf-1（p-Raf-1）的表达水平（P＜0．01），且tMfn2作用更明显（P＜0．01）。4．结论与Mfn2基因相比，tMfn2基因更能显著抑制VSMCs增殖，使细胞周期停滞于G0/G1期，这一作用主要是通过抑制Ras-Raf-ERK1/2信号通路，下调磷酸化Raf-1蛋白表达，进而抑制ERK1/2的磷酸化而实现。第三部分tMfn2基因对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响1．目的线粒体融合素基因2（Mfn2）对大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）的增殖和凋亡都有影响，因此推测去除穿膜区序列的大鼠线粒体融合素基因2（tMfn2）对VSMCs凋亡可能也有作用，本文进一步探讨tMfn2基因对VSMCs凋亡的影响和相关信号通路。2．方法用Adv-tMfn2和Adv-Mfn2分别感染VSMCs，检测tMfn2蛋白和Mfn2蛋白在细胞中的表达水平。采用流式细胞术、细胞凋亡ELISA、TUNEL染色等方法检测tMfn2对VSMCs凋亡的影响；Western blot分析磷酸化Akt（p-Akt）蛋白和线粒体凋亡路径中Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-9蛋白表达变化。3．结果Adv-tMfn2和Adv-Mfn2感染VSMCs后能有效表达出相应蛋白；流式细胞仪检测和ELISA结果表明，tMfn2组的凋亡细胞明显较Mfn2组增多，且呈时间依赖性，随着时间的延长，tMfn2促凋亡作用增强（P＜0．01）；TUNEL染色发现tMfn2组的棕黄色颗粒明显多于Mfn2组，说明前者促凋亡作用更显著（P＜0．01）；Western blot结果显示，tMfn2和Mfn2组中p-Akt水平均明显降低，但前者作用更强（P＜0．01）；进一步检测线粒体凋亡路径中的相关蛋白，tMfn2组的Bax蛋白表达显著升高、Bcl-2蛋白表达显著降低，且cleaved caspase-9的活性明显增强，较Mfn2诱导凋亡的作用更强（P＜0．01）。4．结论tMfn2基因同样显著诱导VSMCs凋亡，且其作用随着时间的延长而增强。tMfn2基因的作用主要是通过抑制Ras-PI3K-Akt信号路径来实现，可显著抑制Akt磷酸化，从而激活线粒体凋亡途径，导致VSMCs凋亡。