论文部分内容阅读
斜纹夜蛾核型多角体病毒（Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus，SpltMNPV）属NPV科A亚群。国内于1972年在广州地区首次从野外死亡的斜纹夜蛾虫体分离到这种病毒。其宿主斜纹夜蛾（Spodoptera litura，Spli）是鳞翅目夜蛾科的杂食性害虫，分布范围广，是我国粮棉、油等经济作物和蔬菜的重要害虫之一。应用SpltMNPV防治斜纹夜蛾是一种有效的生物防治方法，而通过基因工程手段构建新的高效杀虫病毒是改良生物病毒杀虫剂的重要途径。从分子水平深入地阐明SpltMNPV在体内的侵染、增殖规律、建立SpltMNPV载体表达系统是达到上述目的的理论基础和技术准备。因此，近年来对SpltMNPV的研究受到广泛关注，有关该病毒的序列测定、基因结构、功能和表达调控等分子生物学研究工作进展迅速，特别是对一些重要基因的结构分析，有助于筛选毒力较强的杀虫毒株，并为这一病毒杀虫剂的改良和发展以及组建昆虫杆状病毒表达载体奠定基础。本研究在Spli-SpltMNPV的模型中对ie0／ie1及25k基因进行了结构与功能的初步研究，主要工作及成果如下：1．克隆并表达了SpltMNPV日本C3株ie0基因，该基因编码区含864bp核苷酸，编码分子量为33124D的多肽（GenBank登陆号：AY 727987）。分析了该基因的核苷酸和氨基酸序列特征，进行了IE0蛋白的二级结构预测以及分子系统发育分析。序列分析发现，在SpltMNPV IE0蛋白N-端23-47位以及111-126位富含酸性氨基酸和疏水性氨基酸残基，C-端第225-271位具有典型的CX2CX14CCX4CX2CX15CX2C双锌指基序，该结构在所比较的9种昆虫核型多角体病毒IE0蛋白中是十分保守的。将ie0基因克隆至原核表达载体pET28a（+），经IPTG诱导，SDS-PAGE显示该蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中获得了表达，同时进行了westem blot鉴定。2．构建了以GFP为标记的转移质粒pSplt—ie0和pSplt—ie1，使用能直接被宿主细胞识别的极早期基因ie0和ie1的启动子。将pSplt—ie0和pSplt—ie1转染Sf9细胞，瞬时表达的IE0和IE1蛋白能引起非宿主细胞的凋亡。结合三种凋亡抑制剂对SpltMNPV诱导的细胞凋亡的影响，对IE0和IE1蛋白诱导的细胞凋亡机制进行了初步研究。结果表明，IE0和IE1蛋白能够引起非宿主细胞的凋亡，其诱导凋亡的能力与其瞬时表达的量呈正相关，但有一阈值。其引起凋亡的途径可能是由于IE0和IE1蛋白的表达引起了细胞DNA的非正常复制。3．首次在SpltMNPV中发现了少多角体的遗传变异株。克隆了SpltMNPV日本株A、B、C型的25k基因，与SpltMNPV中国株的核苷酸和氨基酸序列比较发现，由于B型25k基因3′端核苷酸的缺失和插入，导致25k蛋白C端21个氨基酸的改变，引起了多角体明显减少的表型。B型病毒在感染幼虫后期不能使虫体正常降解和液化，推测是由于该基因的表达产物不能正常促进半胱氨酸蛋白酶和几丁质酶的合成所致。