抑制外泌体释放对骨髓间充质干细胞的增殖及氧化应激耐受性的影响

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【背景】心肌梗死是所有心血管疾病患者死亡的主要原因之一,现阶段对心肌梗死的治疗因种种的局限使治疗效果不能令人十分满意。这些年来,我们努力寻找各种治疗方法来促进心肌梗死后心肌的修复和再生;其中移植干细胞疗法备受关注;当前大量研究工作都致力于MSCs及其释放的外泌体在心肌梗死部位发挥心肌保护作用的具体机制,却很少关注外泌体的释放对MSCs本身发挥生物学效应的影响。本文就抑制外泌体的释放对MSCs的增殖能力以及氧化应激耐受性的影响做初步研究。【目的】探讨抑制外泌体释放对骨髓间充质干细胞的增殖及氧化应激耐受性的影响及其初步机制研究。【研究方法】1.首先构建Rab27a敲除小鼠的构建,我们利用TALEN技术靶向性敲除C57BL/6J小鼠Rab27a基因,随后通过表型、基因测序以及Rab27a蛋白的表达来对F1代小鼠进行鉴定,以此来挑选敲除Rab27a的纯合子小鼠,并用纯合子进行繁殖,用作后续的实验。2.为了验证敲除Rab27a后对小鼠骨髓来源的间充质干细胞释放外泌体的影响。我们通过分离并培养野生型小鼠及Rab27a敲除纯合子小鼠骨髓间充质干细胞,采用第3-8代性状稳定的原代间充质干细胞进行后续实验。利用结晶紫染色来检测间充质干细胞的相对数量,利用外泌体提取试剂盒提取间充质干细胞释放到培养基中的外泌体,并用NTA计数外泌体的数量,透射电镜观察外泌体的大小及其形态,WB检测外泌体标记性蛋白CD63。3.为了探讨抑制间充质干细胞外泌体的释放后对其增殖能力的影响。实验分为两个组,分别是来源于野生型小鼠的骨髓间充质干细胞组(WT-MSCs)以及来源于敲除Rab27a纯合小鼠的骨髓间充质干细胞组(KO-MSCs)。通过Edu试剂盒及检测间充质干细胞增殖细胞核抗原(PCNA)的表达来检测两组之间增殖能力的差异。4.为了探讨抑制间充质干细胞外泌体的释放后对其氧化应激耐受性的影响。首先利用H2O2处理MSCs,以此来构建MSCs氧化应激模型,利用MTS试剂盒检测过氧化氢处理后间充质干细胞的细胞活性,并通过Tunel试剂盒检测MSCs经过氧化氢处理后的凋亡水平。【结果】1.与野生型小鼠相比,利用TALEN技术靶向性敲除Rab27a的小鼠因毛囊根部的黑色素小体释放障碍而使其毛发呈现灰白色,同时基因测序可以看到其存在7个碱基的缺失,同时Rab27a蛋白的表达也明显降低。2.利用结晶紫实验来检测KO-MSCs和WT-MSCs的数量,同时利用外泌体提取试剂盒提取MSCs释放的外泌体并用NTA检测外泌体的数量,以此来计算单个MSC释放的外泌体的数量,发现相比于WT-MSCs释放外泌体,KO-MSCs释放的外泌体明显减少。3.Edu试剂盒检测各实验组MSCs增殖能力,结果显示KO-MSCs的增殖能力显著低于WT-MSCs。同时WB检测KO-MSCs和WT-MSCs中增殖细胞核抗原PCNA的表达量,与WT-MSCs相比较,KO-MSCs中PCNA的表达明显下调。4.利用MTS来检测经不同浓度H2O2(0、50、100、200、400μmol/L)处理的间充质干的细胞活性,发现相对于WT-MSCs,KO–MSCs经过高浓度的H2O2(100、200、400μmol/L)处理后细胞活性明显降低。同时用Tunel实验也发现各实验组经H2O2(100μmol/L)处理6h后,与WT-MSCs相比,KO-MSCs凋亡水平明显增加。【结论】利用TALEN技术靶向敲除Rab27a的间充质干细胞外泌体的释放明显减少,同时KO-MSCs细胞增殖能力及氧化应激耐受性明显降低。
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