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土地资源的短缺是制约农业发展的重要因素之一,而土壤盐渍化是全球化的严重问题之一。中国盐渍土壤总面积约1亿hm2,如何开发和利用盐渍土壤,是迫切需要解决的重大问题。利用高新技术培育耐盐植物品种,是有效利用盐渍化土壤的方法之一。在传统育种方法的基础上,应用基因工程方法寻找抗逆基因,提高作物抗逆性,培育抗逆作物品种已成为现代农业研究的重要方向。
本研究以藜科(Chenopodiaceae)超旱生、耐盐植物梭梭(Haloxylon ammodendron)为材料,利用cDNA-AFLP技术对梭梭盐胁迫差异表达基因进行分离,结合RT-PCR和RACE等技术对盐诱导相关基因进行了克隆及序列分析,并利用农杆菌介导花序侵染法对HaPrxQ进行了拟南芥转化。获得结果如下:
1.构建了梭梭盐胁迫诱导后cDNA-AFLP图谱,通过对图谱多态性片段分析,共分离得到112个差异表达的转录衍生片段(TDFs),挑取了16个高表达量且特异的条带进行了克隆、测序和序列分析。其中13个TDFs测序成功,通过BLAST比对发现,有10个TDFs与NCBI中已有的序列同源。这些基因主要参与植物逆境胁迫的表达与调控,包括信号转导、物质能量代谢、光合作用调节、转运体蛋白、逆境响应等。
2.选取四个与梭梭耐盐密切相关的cDNA片段进行克隆及分析,获得了CaBP、PrxQ、ARF1三个基因的全长序列,分别命名为HaCaBP(登录号为JQ023165)、HaPrxQ(登录号为JN657416)、HaARF1(登录号为JN998082)。利用半定量RT-PCR法对这四个基因在梭梭同化枝不同盐浓度、不同时间处理下的表达量进行了分析,结果表明,这四个基因均受盐诱导表达,且表达量随着盐浓度增大及时间的延长而增大。
3.对梭梭HaCaBP、HaPrxQ、HaARF1进行功能域分析,结果显示:HaCaBP属于EF-hand钙结合蛋白超家族,具有4个保守的钙结合位点(efhand),N-末端含有26个氨基酸残基的信号肽序列;HaPrxQ属于硫氧还蛋白家族,N-末端有71个氨基酸残基的叶绿体转运肽;HaARF1属于Ras超家族,具有典型的小GTP结合蛋白结构域。
4.构建重组植物表达载体pCAMBIA2300-HaPrxQ,通过农杆菌介导花序侵染法转化拟南芥,并获得了T1代抗性幼苗。
研究结果为从分子水平探明梭梭的抗旱、耐盐机制,充分挖掘与利用其抗逆基因培育农作物新品种奠定了理论基础。